4215 Revista Estomatológica Herediana Rev. estomatol. hered. 1019-4355 2225-7616 Universidad Peruana Cayetano Heredia Perú faest.revista@oficinas-upch.pe 421564248004 https://doi.org/10.20453/reh.v29i2.3527 ARTICULOS ORIGINALES Atividade anti fúngica do α-terpinen sobre Candida albicans Antifungal activity of α-terpinen on Candida albicans Coradi Tonon Caroline a Serignoli Francisconi Renata b Maquera Huacho Patricia M. b patricia_mmaquera@hotmail.com Ferreira Correia Marília b Alves Ferreira Bordini Ester a de Cássia Orlandi Sardi Janaina c Palomari Spolidorio Denise M. c Faculdade de Odontologia de Araraquara, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”. São Paulo, Brasil Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” Brasil Faculdade de Odontologia de Araraquara, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”. São Paulo, Brasil Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” Brasil Faculdade de Odontologia de Araraquara, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”. São Paulo, Brasil Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” Brasil Faculdade de Odontologia de Araraquara, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”. São Paulo, Brasil Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” Brasil Faculdade de Odontologia de Araraquara, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”. São Paulo, Brasil Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” Brasil Departamento de Ciências Fisiológicas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba. Universidade de Campinas. São Paulo, Brasil Universidade de Campinas Brasil Departamento de Fisiologia e Patologia, Faculdade de Odontologia de Araraquara, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” . São Paulo, Brasil Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” Brasil

Aluna do curso de pós-graduação- Doutorado

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 Abril-Junio 2019 29 2 107 114 18 12 2018 06 05 2019 2019 Universidad Peruana Cayetano Heredia https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/ Esta obra está bajo una Licencia Creative Commons Atribución-NoComercial 4.0 Internacional. https://revistas.upch.edu.pe/index.php/REH/article/view/3527/3879 Resumo

Objetivo: avaliar a atividade antifúngica do α- terpinen sobre culturas planctonicas e biofilme de Candida albicans. Material e Métodos: Primeiramente, foi determinada a Concentração Inibitória Mínima (CIM) e a Concentração Fungicida Mínima (CFM) do α-terpinen sobre microrganismos planctônicos. A Nistatina foi utilizada como controle positivo. Biofilme de Candida albicans foi desenvolvido e, após o tratamento com diferentes concentrações de α-terpinen, foi quantificado em UFC/mL, além da atividade metabólica das células ser avaliada por XTT. Resultados: a menor concentração capaz de inibir o crescimento (CIM) foi 0,2 % para o α-terpinen e 4 μg/mL para a Nistatina. Na CIM, os resultados mostraram que a partir da concentração 0,05 % de α-terpinen e 2 μg/mL de Nistatina houve diminuição de C.albicans quando comparado ao controle. A CFM foi para α-terpinen 0,2 % e Nistatina 8 μg/mL. Na quantificação as concentrações eficazes foram de α-terpinen (0,1%) e Nistatina (128μg/mL), e no teste do XTT, observou-se que α –terpinen (0,1%) e Nistatina (256μg/mL) diminuem a viabilidade quando comparado com o controle. Conclusão: Assim, pode-se afirmar que α-terpineol pode ser uma alternativa para tratamento de infecções fúngicas.

 Palavras-chave Candida albicans biofilme nistatina Keywords Candida albicans biofilm nystatin INTRODUÇÃO

A cavidade oral apresenta aproximadamente 700 microrganismos distintos, os quais formam a microbiota mais complexa do corpo humano. Esses microrganismos, incorporados a uma matriz de substâncias poliméricas compõem o biofilme dental (1) e essa associação favorece as trocas metabólicas, genéticas inter e intra-espécies (2,3,4). Com isso, os microrganismos na forma de biofilme são menos susceptíveis aos antimicrobianos que na forma planctônica (5,6,7).

Má qualidade de higiene bucal e alguns fatores predisponentes, juntamente com o biofilme, podem gerar infecções fúngicas, sendo que a candidíase é uma das principais. A levedura do gênero Candida é a causadora da candidíase bucal, a qual é um microrganismo saprófito, que, devido à fatores predisponentes, pode ser tornar patogênico (8). A capacidade de aderir, colonizar e formar tubos germinativos na mucosa oral contribui para o seu desenvolvimento.

Os agentes antifúngicos mais utilizados na prevenção e tratamento contra o gênero Candida são a anfotericina B, nistatina e fluconazol. A nistatina, usada no tratamento do candidíase oral, é um antifúngico poliênico, que apresenta características fungicidas e fungistática (9), atua na desestruturação da membrana celular de fungos e leveduras e na permeabilidade da membrana celular (10). Porém, estudos têm demonstrado a existência de Candida albicans resistentes e que alguns medicamentos ocasionam lesões nos rins e fígado (11).

Assim, extratos vegetais e compostos fitoquímicos vem sendo cada vez mais utilizados na medicina, sendo que uma grande porcentagem das novas moléculas descobertas provém de constituintes de plantas e/ou derivados semi-sintéticos. Estudos com produtos de origem natural apresentaram resultados entusiasmantes sobre os patógenos bucais, no controle da resposta inflamatória mostrando que estes agentes fitoterápicos podem ser veículos de prevenção e controle de doenças bucais infecciosas (12).

O α-terpinen é um monoterpeno, encontrado na Melaleuca alternifoila ou Tea Tree Oil (TTO) e outras plantas como Hajeb Layoun arboreta e Alpinia zerumbet. Atua induzindo a perda da membrana, o que interfere na integridade e na fisiologia da célula do micro-organismo (13), além de apresentar amplo espectro de atividade antimicrobiana (antibacteriana, antiviral e antifúngica) e atividade antiinflamatória (14,15). Estudos in vitro relacionam o uso medicinal deste produto à eficácia no tratamento de diversas infecções bacterianas (16,17,18) e fúngicas, como a candidíase (7,19,20).

Dessa forma, o presente estudo teve como objetivo avaliar a atividade antifúngica do α-terpinen sobre Candida albicans na forma planctônica e em biofilme.

 MATERIAL E MÉTODOS <italic>Reativação da espécie</italic>

Foi utilizada neste estudo cepa de referência de Candida albicans (ATCC 5314), reativada em meio de cultura RPMI 1640 (Sigma, MO, USA) (pH 7.0) com 0,165M MOPS (ácido 3-(N-morfolino) propanosulfônico) a 37ºC por 18h. A suspensão, então, foi centrifugada e as células lavadas 2 vezes com solução salina tampão fosfato (PBS) estéril. Em seguida, o material resultante teve sua turbidez ajustada a 600 nm até atingir absorbância correspondente a 1x105 UFC/mL.

 <italic>Preparo das soluções</italic>

O α-terpinen (Sigma, MO, USA) foi diluído em RPMI 1640 nas concentrações 0,1% - 0,0064%, acrescido de DMSO 0.4% (Sigma, MO, USA) como solubilizante (12).

A nistatina (Sigma, MO, USA) foi utilizada como controle positivo. Foram realizadas diluições em DMSO nas concentrações 0,03125 – 64 μg/mL de acordo com a norma CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) (21).

 <italic>Análise antimicrobiana do α-terpinen em microrganismos planctônicos (CIM e CFM)</italic>

Foi empregado o método de microdiluição em caldo em placas de microtitulação de 96 poços para a determinar a Concentração Inibitória Mínima (M27-A2 – CLSI) (21). Cada poço recebeu 200 μL das diluições e 2 μL da suspensão de Candida albicans, resultando numa concentração final de 1x103 UFC/ mL. O meio de cultura RPMI 1640 foi utilizado como controle negativo.

As placas foram incubadas por 24 h a 37ºC em agitador a 75 rpm (Rotações por minuto). Decorrido esse período, os poços foram examinados visualmente para comprovar a presença de turvação e absorbância foi determinada a 590 nm em leitor de ELISA. Todos os ensaios foram realizados em triplicata em três momentos diferentes (n=9).

Dos poços que não mostraram crescimento visível foram retiradas duas alíquotas, as quais foram plaqueadas em meio de cultura Saboraude Dextrose Agar e mantidas a 37ºC por 48 horas, para a determinação da Concentração Fungicida Mínima. A CFM foi definida como a menor concentração capaz de reduzir o inóculo inicial a ≥ 99.9%.

 Análise antimicrobiana do α-terpinen em biofi lme <italic>Formação do biofilme</italic>

O biofilme foi formado em placas de microtitulação, como descrito por Thein et al. (22). Culturas de Candida albicans foram reativadas e transferidas para placas de 96 poços (100 μL para cada poço). As placas foram incubadas a 37ºC por 1 hora e 30 minutos, em agitador a 75 rpm, tempo que correspondeu à fase de adesão dos microrganismos à superfície dos orifícios. Após este tempo, a suspensão foi aspirada e os poços foram lavados com PBS (Phosfate Buffered Saline) estéril para a remover os microrganismos não aderidos. 100 μL de RPMI 1640 foi adicionado em cada poço para promover o crescimento do biofilme e mantidos a 37ºC por 48 h a 75 rpm para posterior análise.

 <italic>Efeito do α-terpinen em biofilme</italic>

Para explorar a ação do α-terpinen na formação de biofilme, após 48 h, o meio de cultura foi trocado por 100 μL das diluições de α-terpinen e nistatina, sendo que poços sem tratamento foram utilizados como controle negativo do biofilme. As placas foram mantidas em incubadora a 37ºC por 24 h, sendo posteriormente o efeito do α-terpinen e nistatina sobre o biofilme analisado pelo método de XTT.

 <italic>Análise da viabilidade do biofilme (Teste de XTT)</italic>

O ensaio de XTT é um teste de viabilidade celular, colorimétrico, e que permite realizar uma estimativa do metabolismo ativo microbiano por meio da redução das enzimas desidrogenase presentes no sistema de transporte de elétrons no cristal de formazano (23). O sal de XTT (2,3 - Bis - (2- Methoxy - 4 - Nitro - 5 - Sulfophenyl) – 2H - Tetrazolium-5-Carboxanilide, Sigma, MO, USA) foi preparado em água ultra purificada na concentração final de 1 mg/mL. A solução foi filtrada e estocada a -80 ºC. Solução de menadiona (Sigma, MO, USA) foi preparada em acetona a 0.4 mM previamente ao experimento. Após as 24 horas de incubação, as soluções de tratamento foram removidas dos poços e estes foram lavados 2 vezes com PBS estéril. 200 μL de solução de XTT (contendo 158 μL de PBS com 200 mM glicose, 40 μL de XTT e 2 μL de menadiona diluída) foram adicionados a cada poço e as placas permaneceram incubadas por 3 h no escuro a 37 ºC, sendo, então, a absorbância determinada em 492 nm. Todos os ensaios foram realizados em triplicata e três momentos diferentes (n=9).

 <italic>Quantificação do biofilme</italic>

Para a quantificação em Unidades Formadoras de Colônias (UFC/mL), 3 poços (n=3) de cada grupo experimental e controle foram utilizados para a análise. Cada poço lavado duas vezes com PBS estéril e a massa do biofilme foi raspada cuidadosamente na presença de 100 μL de PBS. Todo o procedimento foi padronizado e realizado por um único operador. A suspensão resultante foi diluída e plaqueada em meio Sabourad Dextrose Ágar e as placas foram mantidas a 37ºC por 48 horas. Todos os ensaios foram realizados em triplicata em momentos diferentes. A contagem das colônias foi realizada por um pesquisador imparcial à pesquisa e a reprodutibilidade inter-examinador foi avaliada calculando os coeficientes de correlação intra-classe (CCI) e o intervalo dos limites de 95%.

 RESULTADOS <italic>Avaliação: CIM e CFM</italic>

A tabela 1 mostra os resultados para CIM e a CFM de α-terpinen. A menor concentração capaz de inibir o crescimento foi α-terpinen 0,2 % e nistatina 4 μg/ mL em culturas planctônicas. Na gráfico 1 observase que a partir da concentração de α-terpinen 0,05 % e nistatina 2 μg/mL houve diminuição dos microrganismos quando comparado com o controle (p<0.05). Entretanto, as menores concentrações fungicidas foi α-terpinen 0,2%, e nistatina 8μg/mL (tabela 1).

 <italic>Quantificação do biofilme</italic>

Em relação ao biofilme (gráfico 2), a partir da concentação 0,1% de α- terpinen houve diferença estatisticamente significante em relação ao controle, sendo que a concentração 0,2% foi mais eficaz. Para a nistatina, concetração 256 μg/mL foi capaz de eliminar totalmente o biofilme (p<0.05).

 <italic>Teste de viabilidade: XTT</italic>

A gráfico 3 mostra que a partir de α-terpinen 0,1 % e nistatina 256 μg/mL houve diminuição da viabilidade celular quando comparado ao controle (p<0.05). Dessa forma, considerou-se que o α-terpinen é capaz de diminuir, mas não eliminar, a viabilidade celular de Candida albicans em biofilme.

Tabela 1.Concentração inibitória mínima (CIM) visual e Concentração fungicida mínima (CFM) do α-terpinen sobre cultura planctônica de <italic>C. albicans</italic> (ATCC 5314).

<bold>Gráfico 1</bold>. Atividade antifúngica do α-tepinen e Nistatina (Nis) sobre culturas planctônicas de Candida albicans(ATCC 5314). Letras diferentes indicam diferença estatística. Médias iguais a 0,00 não entram no teste de ANOVA. Atividade anti fúngica do α-terpinen sobre <italic>Candida albicans</italic>

<bold>Gráfico 2</bold>. Atividade antifúngica (UFC/mL) do α-terpinen e Nistatina (Nis) em biofi lme de <italic>Candida albicans</italic>(ATCC 5314). Letras diferentes indicam diferença estatística. Médias iguais a 0,00 não entram no teste de ANOVA.

<bold>Gráfico 3</bold>. Atividade antifúngica (XTT) do α-terpinen e Nistatina (Nis) em biofilme de <italic>Candida albicans</italic> (ATCC 5314). Letras diferentes indicam diferença estatística

DISCUSSÃO

Existe grande procura por produtos alternativos para tratamentos de infecções, já que há grande disseminação de microrganismos resistentes a antimicrobianos. Nesta linha de pesquisa, como mostrado anteriormente, encontra-se o Tea Tree Oil (TTO), utilizado para tratamento de fungos, principalmente Candida albicans (24). O TTO tem mostrado sucesso em diversos estudos, e apresenta propriedades antimicorbianas e antiinflamatórias. Porém, ainda são necessárias muitas evidências clínicas para o uso seguro do óleo (19).

No presente estudo os efeitos do componente α-terpinen foram analisados tanto em culturas planctônicas, quanto em biofilmes de Candida albicans. A tabela 1 mostra os restuldados para CIM e CFM e a gráfico 1 mostra o efeito antifúngico dosedependente do α-terpinen nos fungos em suspensão. As concentrações encontradas são semelhantes às descritas na literatura por Ramage et al. (CIM90 de 0,5%) (25), Trinh et al. (CIM de 0,125% e CFM de 0,25%) (26) e Hammer et al. (CIM entre 0 – 12% e CFM entre 0 – 25%) (27).

Na análise do teste do XTT, o propósito foi verificar a viabilidade do biofilme sobre diferentes concentrações do componente. Pode-se observar que conforme aumenta a concentração, a viabilidade do biofilme diminui. Na quantificação do biofilme (UFL/mL) observa-se que, a partir da concentração 0,1% do α-terpinen houve diferença estatisticamente significante em relação ao grupo controle. Porém, por se tratar de biofilme, a eficácia do α-terpinen foi menor ao compararmos com os resultados em culturas planctônicas.

No estudo de Ramage et al., (25), o α-terpinen inibiu o crescimento do biofilme quando este foi tratado por 0, 1 e 2 horas após sua formação, reduzindo rapidamente a viabilidade após 2 min de cerca de 55% do biofilme. Esta atividade manteve-se, reduzindo a viabilidade do biofilme em cerca de 61, 75, e 94% após 5, 15, e 60 min, respectivamente. Os α-terpinen, assim como terpinen-4-ol, mostraram melhor atividade do que TTO em 60 min.

A Candida albicans em muitas formas de avaliação tem alta sensibilidade ao TTO e aos seus componentes.

Este comportamento é explicado por Carson et al. num estudo que mostrou que, assim como foi encontrado para as bactérias, o TTO altera a permeabilidade das células de Candida albicans e Candida glabrata (19).

Outras pesquisas demonstram que a fluidez da membrana das células de Candida albicans é significativamente aumentada, confirmando que o óleo altera substancialmente as propriedades da membrana (28). O TTO também inibe a respiração em Candida albicans em uma maneira dependente da dose (29), além de inibir Candida albicans, Candida glabrata, e Saccharomyces cerevisiae por meio de acidificação induzida pela glicose. A acidificação ocorre em grande parte pela expulsão de prótons ATPase de membrana do plasma, a qual é alimentada por ATP derivado da mitocôndria. A inibição desta função sugere que o plasma e / ou membranas mitocondriais foram afetados negativamente. Estes resultados são consistentes com um mecanismo proposto de acção antifúngica no qual TTO provoca alterações ou danos no funcionamento das membranas de fungos (28). No mesmo estudo, os autores demonstraram que o tratamento de Candida albicans com óleo e seus componentes alterou tanto a permeabilidade quanto a fluidez da membrana. A formação de tubos germinativos, ou a conversão micelial de Candida albicans também é inibida pelo TTO (19).

Considerável atenção tem sido dada para a questão de quais os componentes de TTO são responsáveis pela atividade antimicrobiana. As primeiras indicações são de que a atividade pode ser atribuída principalmente ao terpinen-4-ol e ao α-terpinen, sendo que o α-terpinen representa uma percentagem de 2-12% do óleo de Melaleuca alternifólia, com CIMs e CFMs que são geralmente os mesmos ou ligeiramente menor do que os valores obtidos para TTO (30).

Sobre a segurança e toxicidade de TTO e seus componentes, estudos avaliam a citotoxicidade de componentes TTO contra várias linhas de células demonstraram que terpinen-4-ol, α-terpinen, terpinoleno, α-felandreno, aromadendreno, sabinene e α e β-pineno foram mais ativos do que o TTO (31,32), ao passo que 1,8-cineol pareceram ser menos ativos do que TTO (31). No estudo de Ramage et al. o TTO e Terpinen-4ol (CIM50 = 0,25%) foram citotóxicos tanto para fibroblastos quanto para células epiteliais, porém, ao utilizar 0.5 x CIM50, TTO e Terpinen-4-ol nao demonstrou toxicidade (25).

No estudo de Nogueira et al. o TTO 0,031% e o Terpinen- 4-ol 0.119 % foram citotóxicos para macrófagos, porém α-terpinen não apresentou redução de 50% da viabilidade em nenhuma das concentrações testadas (0.0064 - 0.0007 %)(15).

Apesar dos avanços na caracterização das propriedades antimicrobianas e anti-inflamatória do TTO e poucos trabalhos terem sido feitos sobre a segurança e a toxicidade do óleo, a razão para o seu uso continuado é em grande parte o uso aparentemente seguro do óleo por quase 80 anos. Evidências ao longo deste tempo sugerem que o uso tópico é seguro e que os eventos adversos são menores, auto-limitados, e pouco frequentes (16).

Apesar dos resultados promissores deste estudo, algumas limitações podem ser encontradas em relação ao curto período de formação do biofilme que pode não ser o suficiente para representar um biofilme dental maduro. Além disso, mais espécies de Candida envolvidas com a formação de biofilme devem ser estudadas para fornecer um melhor conhecimento do papel do α-terpinen na inibição do biofilme.

Assim, de acordo com nossos resultados, α-terpineol pode ser uma alternativa para tratamento de infecções fúngicas. Pesquisas in vitro e in vivo devem ser realizadas para investigar outros possíveis mecanismos de ação do α-terpineol e sua segurança e toxicidade, a fim de desenvolver novas formulações que sejam capazes de inibir a adesão e a progressão de infeções por Candida spp.

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