La muestra vegetal de la planta A. indica se obtuvo de un árbol localizado en el jardín de la Universidad de Carabobo Sede Aragua, y la muestra vegetal de la planta E. camaldulensis se recolectó en el Parque Ecológico Universitario “Simón Bolívar”, en la Universidad Central de Venezuela, Núcleo Aragua. Ambas muestras estuvieron constituidas por hojas, que se certificaron en el herbario “Víctor M. Badillo” de la Facultad de Agronomía, Universidad Central de Venezuela, Núcleo Aragua.

Las hojas fueron lavadas, secadas a temperatura ambiente y llevadas a una estufa a 45°C durante 24 horas. Luego se trituraron por separado en un mortero y se colocaron en un molino de bolas durante seis horas para obtener un polvo finamente pulverizado.

Se disolvieron 32 g del material vegetal pulverizado de cada una de las plantas, en 500 mL de solución salina al 0,9%, llevándose a cocción durante treinta minutos en una plancha de calentamiento a una temperatura de 150°C. Las soluciones se prepararon por separado, se dejaron enfriar a temperatura ambiente, y se dividieron en fracciones pequeñas, luego fueron centrifugadas durante 10 minutos a 3.000 rpm. Los sobrenadantes se filtraron con papel Whatman Nº 2, se almacenaron y conservaron las muestras a -20°C. Las concentraciones de las soluciones fueron de 6,4% m/v (6,4 g/dL), a partir de las cuales se prepararon las siguientes dosis de las soluciones acuosas: 0,01; 0,05; 0,175; 0,5; 0,7 y 1,4 g/dL.

Se extrajeron 5 mL de sangre venosa del antebrazo de donantes voluntarios sanos que estuvieron de acuerdo en participar en la investigación mediante la aceptación del consentimiento informado, y se colocaron en un tubo de ensayo con anticoagulante ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), se tomaron 4 mL de sangre de cada una de las muestras y se utilizaron para la separación de leucocitos y el mililitro restante se tomó como control sin centrifugar.

Para la separación de leucocitos se centrifugaron 4 mL de sangre durante 5 minutos a 2.700 rpm con un rotor JA-20, marca Beckman®, se descartó el plasma y se tomó 1 mL de la primera capa de células, en donde se concentra la mayor parte de los leucocitos, luego se dividió en dos alícuotas de 500 µL (A y B), estas fueron lavadas con 600 µL de tampón fosfato salino para eliminar los restos de plasma. El contaje de células se realizó en un analizador hematológico marca Mindray BC-2300.

Para los ensayos de consumo de glucosa se seleccionó la alícuota (A o B), en donde se obtuvo la mayor concentración de leucocitos, extrayendo de ésta el volumen adecuado que contuviera 10⁶ leucocitos.

Los ensayos de consumo de glucosa se realizaron empleando diferentes volúmenes de las soluciones acuosas de la A. indica y del E. camaldulensis, y se utilizó insulina como control, por ser el hipoglucemiante endógeno más potente (González et al. 2011, Rodríguez y Salguero 2011), pero manteniendo siempre un medio normoglucémico con volumen constante de 1 mL, tal como se describe a continuación.

Se incubaron las muestras de 106 leucocitos a 37°C, durante un tiempo comprendido entre 0 y 10 minutos en 600 µL de un medio iónico apropiado (Hepes-KOH 20 mM pH 7,5, tampón fosfato 5 mM, pH 7,5; KCl 2,5 mM, NaCl 70 mM y Mg2SO4 2,5 mM), bajo condiciones normoglucémicas, lo cual se obtuvo agregando 55 µL de solución de glucosa 0,1 M, equivalente a 99 mg/dL para un volumen final de 1 mL. Adicionalmente, se agregó insulina Humulin® en concentraciones de 0,1; 1 y 10 nM para los controles, y para los tratamientos, las soluciones acuosas de las plantas A. indica y E. camaldulensis en concentraciones de 0,01; 0,05; 0,175; 0,5; 0,7 y 1,4 g/dL, para lo cual se agregaron 1,6; 8; 27; 78; 109 y 219 µL de la solución madre al 6,4% m/v, respectivamente, los volúmenes faltantes para alcanzar 1 mL se completaron con agua destilada (Tabla 1)

Tabla 1. Tabla 1. Volumen de los componentes de la solución empleada para los ensayos de consumo de glucosa.

Una vez iniciada la incubación, se tomaron alícuotas de 40 µL de cada uno de los ensayos, en tiempos sucesivos desde el inicio (0 minutos) hasta 10 minutos (0; 1,5; 3,5; 5 y 10 minutos), centrifugándose a 4.000 rpm durante 2 minutos en una microcentrífuga Eppendorf® 5415, luego se tomaron 5 µL del sobrenadante y se mezclaron con 500 µL del reactivo de glucosa (Bioscience) siguiendo las instrucciones del fabricante y posteriormente, se registraron las absorbancias de los diferentes medios en un espectrofotómetro Beckman® DU 650.

Los ensayos se realizaron utilizando un arreglo de factorial de tratamientos, donde el primer factor lo constituyeron las plantas A. indica y E. camaldulensis, y el segundo factor lo constituyeron las dosis de las soluciones (0,01; 0,05; 0,175; 0,5; 0,7 y 1,4 g/dL), en un diseño en bloques al azar, siendo los bloques los donantes de los cuales se extrajeron las muestras sanguíneas, adicionalmente las variables se midieron en los instantes 0, 90, 210, 300 y 600 segundos, (0; 1,5; 3,5; 5 y 10 minutos). Sobre este arreglo se aplicó el análisis de varianza de un diseño en parcelas divididas, siendo la parcela principal las combinaciones de tratamientos de las plantas y las concentraciones de las soluciones acuosas, y la parcela secundaria las observaciones medidas a través del tiempo. Asimismo, las comparaciones de medias se llevaron a cabo utilizando la prueba de comparaciones múltiples de Tukey, y las interacciones se analizaron de forma gráfica. Los análisis se llevaron a cabo utilizando los programas estadísticos SAS 9.2, Minitab 16.0 y Statistix 9.0, bajo ambiente Windows.

El análisis de varianza mostró que no hay diferencias significativas para el consumo promedio de glucosa según la planta utilizada (p = 0,2708), ni para las concentraciones de la solución acuosa (p = 0,8282), ni para la interacción planta×solución acuosa (p = 0,9989); sin embargo, sí se encontraron diferencias significativas a través del tiempo (p < 0,0001) (Tabla 2), y para la interacción planta×tiempo (p = 0,0137) (Fig. 1), las interacciones solución acuosa×tiempo (p = 0,8052) y planta×solución acuosa×tiempo (p = 0,9510), fueron no significativas.

La concentracion de glucosa presentó tendencia a disminuir a través del tiempo (Fig. 1), la reducción fue más marcada y estable para la planta A. indica, lo cual indicó que el efecto hipoglucemiante fue mayor que el de E. camaldulensis, asimismo, la concentración de glucosa fue estadísticamente igual en los primeros instantes del ensayo, pero presentó una reducción significativa a partir de los 210 segundos del ensayo (Tabla 2).

Tabla 2. Tabla 2. Pruebas de medias de Tukey para el contenido de glucosa medido a través del tiempo [Segundos] Tabla 2

Tratamientos con igual letra no presentan diferencias significativas.

Figura 1 Figura 1 Consumo de glucosa [mg/dL] medido a través del tiempo [seg] y clasificado según la planta utilizada.

En la Figura 2 se compara la acción de las dosis altas de las soluciones acuosas de las plantas E. camaldulensis y A. indica en los diferentes tiempos de reacción. Al utilizar la concentración más alta de la solución acuosa (1,4 g/dL) de E. camaldulensis, se pudo observar un descenso en los niveles de glucosa en el medio extracelular con relación al grupo control a través del tiempo, aproximadamente 30,5%; sin embargo, al utilizar las dosis más altas de la solución acuosa de A. indica (0,7 y 1,4 g/dL), se observó que para la primera dosis el consumo comenzó a partir de los tres minutos, disminuyendo la concentración de glucosa a 89,8 mg/dL; para la segunda dosis el consumo comenzó al minuto 1,5, reduciendo la concentración de glucosa en el medio a 87 mg/dL, y llegando a ubicarse en 65,7 mg/dL a los 10 minutos.

Figura 2. Figura 2. Comparación de los consumos de glucosa [mg/dL] con las concentraciones de solución acuosa [g/dL] según la planta utilizada.

Figura 3 Figura 3 Reducción en el contenido de glucosa [%] medido a través del tiempo [seg] y clasificado según la planta utilizada.

El análisis de varianza mostró que hay diferencias significativas para el porcentaje de reducción de la concentración de glucosa según la planta utilizada (p = 0,0074), y para las dosificaciones de solución acuosa (p = 0,0439), pero no para la interacción planta×solución acuosa (p = 0,9358), además, se encontraron diferencias significativas a través del tiempo (p < 0,0001), y para la interacción planta×tiempo (p < 0,0001), adicionalmente, las interacciones solución acuosa×tiempo (p = 1,0000) y planta×solución acuosa×tiempo (p = 1,0000), fueron no significativas.

La prueba de medias de Tukey para la planta utilizada mostró que hubo una reducción mayor para la solución acuosa de la planta de A. indica, lo cual evidencia su mayor efecto hipoglicemiante, el valor negativo para E. camaldulensis indica que en la solución acuosa se midieron concentraciones de glucosa mayores a las del control (Tabla 3).

Tabla 3. Tabla 3. Prueba de medias de Tukey para la reducción en la concentración de glucosa [%]. Tabla 3

Tratamientos con igual letra no presentan diferencias significativas.

En las dosificaciones de solución acuosa utilizadas, la prueba de medias de Tukey demostró que el mayor efecto hipoglicemiante ocurrió para la dosis de 1,4 g/dL, aun cuando en general se observa un incremento en el consumo de glucosa a partir de la dosis 0,175 g/dL, los valores negativos indican que las dosificaciones de la solución acuosa de las plantas fueron en promedio mayores a las del control, estos promedios fueron calculados para las dos plantas en todos los instantes considerados (Tabla 4).

Tabla 4. Tabla 4. Prueba de medias de Tukey para la reducción en la concentración de glucosa [%]. Tabla 4

Nota: Tratamientos con igual letra no presentan diferencias significativas.

La prueba de medias de Tukey mostró que en general, la reducción en la concentración de glucosa tiende a ser mayor a través del tiempo, con la notable excepción a los 300 segundos, la cual presentó un comportamiento anómalo debido a un valor inusualmente elevado con signo negativo para la planta E. camaldulensis (Tabla 5).

Tabla 5. Tabla 5. Prueba de medias de Tukey para la reducción en la concentración de glucosa [%]. Tabla 5

Tratamientos con igual letra no presentan diferencias significativas.

La gráfica de la interacción muestra que la reducción en la concentración de glucosa solo fue creciente y estable para la solución acuosa de la planta A. indica, mientras que el comportamiento fue muy inconsistente para la solución acuosa de E. camaldulensis, esto evidencia que efectivamente el efecto hipoglucemiante fue mayor y más confiable para A. indica (Fig. 3).