En la actualidad los requerimientos de los laboratorios de análisis de alimentos y de sus usuarios, en cuanto a tiempos de respuesta, confiabilidad de los resultados y relación costo-servicio-beneficio, son más frecuentes y necesarios. Esto obliga a optimizar procesos analíticos para lograr dar respuesta a la demanda. Por esta razón, actualmente muchos laboratorios están incluyendo en su plantilla de análisis la metodología Dumas en sustitución del tradicional Khjeldal para el análisis de proteínas, debido a que los tiempos de respuesta son más rápidos, sus resultados son reproducibles y no utiliza reactivos como NaOH y H2SO4, que suelen incrementar costos y son potenciales contaminantes al ambiente. Tomando en cuenta esto, surgen discusiones a nivel técnico sobre cuál sería la mejor metodología para determinar nitrógeno (y por consiguiente proteínas) en matrices de alimentos (Bellomonte et al. 1987, Watson y Galliher 2002, Cruz et al. 2007).

La metodología Kjeldhal número 2.062 de AOAC (AOAC 1984), actualmente, sigue siendo el método oficial más usado. Éste emplea una digestión ácida (con ácido sulfúrico y catalizadores) y requiere un tiempo significativo de hasta 10 horas. Por lo general, la digestión se realiza a 420ºC. La reacción forma sulfato de amonio, que en exceso de hidróxido de sodio genera amoniaco, el cual se destila y se titula para determinar el contenido de nitrógeno en la muestra a estudiar. Desde el punto de vista operativo, es un método complejo que necesita tiempo, costos e involucra una serie de puntos críticos que pueden ser fuentes de error. Por otra parte, la metodología Dumas número 990.03 de AOAC (AOAC 2005) se fundamenta en el principio de destrucción de la materia orgánica a través de una combustión bajo un suministro de oxígeno controlado, a muy altas temperaturas. Consta de cuatro etapas, en la primera etapa se genera una combustión, donde la muestra es incinerada alrededor de 900ºC en presencia de oxígeno. La siguiente etapa es una reducción, donde el óxido nítrico producido por la combustión es reducido por el tungsteno a nitrógeno molecular. Luego pasa por una etapa de purificación, donde una serie de absorbentes adecuados (lana de plata y tungsteno) remueven los constituyentes interferenciales tales como los haluros de hidrógeno y los óxidos de azufre del flujo de la mezcla gaseosa. El vapor de agua resultante es condensado y retenido por un agente desecante (pentóxido de fósforo), posteriormente al proceso de reducción, donde procede un secado fino. Finalmente, la detección del nitrógeno se realiza con un detector de conductividad térmica el cual mide el nitrógeno total remanente en un flujo de gas transportador. En la metodología de Dumas, utilizando tecnología automatizada, el tiempo de análisis es de aproximadamente 7 minutos. Es un sistema cerrado (el operario no está expuesto a éste) y no utiliza ácidos, por lo tanto no produce desechos peligrosos y no tiene riesgos operativos para el personal (Etheridge et al. 1998, Cruz et al. 2007). En vista que ambos métodos se aplican en el Laboratorio de Análisis Físico Químico del Instituto Nacional de Nutrición, se procedió a realizar una comparación entre ambos para determinar si existía una correlación significativa entre ambos métodos de análisis, para lo cual se evaluaron 24 muestras correspondientes a distintas matrices de alimentos.

Los resultados obtenidos para el porcentaje de proteínas por ambos métodos de análisis, se presentan en la Tabla 1. El método de Kjeldahl genera mayores desviaciones en el contenido de proteínas en las muestras de alimentos analizadas, en comparación con las obtenidas por el método de Dumas, lo que conduce a una mayor dispersión en los resultados. La dispersión generada por la aplicación del método de Kjeldahl, puede ser atribuida a que este procedimiento tiene un mayor número de factores y procesos, en donde el error humano y los procedimientos de pre-tratamiento de las muestras son puntos críticos y pueden generar un aumento o disminución en la dispersión de los resultados obtenidos. De igual manera las deviaciones son muy bajas para ambos métodos, presentando un máximo de 0,096 por el método Kjeldahl y 0,050 por el método automatizado, Dumas.

Tabla 1. Tabla 1. Porcentajes de proteínas presentes en las muestras de alimentos analizadas por los métodos de Kjeldahl y Dumas.

La Tabla 2 muestra el resumen estadístico del análisis de regresión de los datos del contenido de proteínas obtenido por ambos métodos sobre las mismas muestras. Para los cálculos los datos correspondientes al método de Dumas se han representado en el eje de las y; los obtenidos por el método de Kjeldahl en el eje x, por ser el método de referencia. Los resultados muestran que el valor del coeficiente de correlación múltiple es 0,99843. Es importante indicar que este cálculo se hace asumiendo que los errores sistemáticos y aleatorios correspondientes al método Kjeldahl son despreciables.

Tabla 2. Tabla 2. Descripción estadística del análisis de regresión de los datos obtenidos para el contenido de proteínas por ambos métodos evaluados.

El cálculo del análisis de varianza se presenta en la Tabla 3. De sus resultados se destaca el que la ordenada en el origen es de 0,1887 con límites de confianza (95%) inferior y superior de -0,2222 y + 0,5995 respectivamente, este intervalo incluye el valor ideal de cero. La pendiente de la gráfica, llamada “Kjeldahl” debido a que este método representa el eje x, es 1,0276, con un intervalo de confianza (95%) inferior y superior de 1,0021 a 1,0531; este intervalo es muy próximo a 1,0 que es el ideal. El contraste F aplicado sobre las sumas de los cuadrados es sumamente grande (6986,19) en comparación con el valor crítico (4,91E-029), lo cual indica la relación obvia entre los 2 métodos analíticos debido al promedio de los cuadrados de la regresión, el cual es mucho más grande que el promedio cuadrático de los residuales. En la Figura 1 se presenta la curva de regresión ajustada que indica que tanto el método Kjeldahl como el equipo N-elementar (método Dumas) presentan valores análogos de nitrógeno.

Tabla 3 Tabla 3 Descripción del análisis de varianza producto de la comparación entre los métodos de Dumas y Kjeldahl, en la determinación de proteínas.

Tabla 4 Tabla 4 Datos estadísticos asociados a la predicción de los valores de proteínas por el método de Dumas a partir de los valores obtenidos por el método de Kjeldahl.

Figura 1. Figura 1. Representación Gráfica de la comparación de los porcentajes de proteína (%) por los métodos de Kjeldahl y Dumas.

El análisis realizado indica coeficientes de correlación y regresión próximos a la unidad, un error típico cercano a cero. La recta de regresión cuyas características son la de tener una intercepción cercana a cero y una pendiente a uno, lo cual indica que no existen diferencias significativas entre lo que reportan ambos métodos, por lo tanto, los puntos correspondientes a las mediciones realizadas por el método de Dumas están en torno de la recta ajustada de regresión, tal como puede observarse en la Figura 1. Por otra parte, es importante destacar que los tiempos de análisis requeridos por el método de Dumas son significativamente menores que para Kjeldahl, además no requiere digestión con ácido sulfúrico, por lo tanto se puede considerar el método de Dumas como una alternativa para muestras de rutina en el laboratorio.

Algunos estudios reportados en la literatura llegan a la conclusión obtenida en esta investigación, en concordancia con la buena correlación que existe entre ambos métodos (Cruz et al. 2007, Reussi et al. 2008). Tal es el caso de la investigación desarrollada por Simonne (1997), donde se evaluaron más de 100 tipos de muestras y se determinó que el método Dumas podía reemplazar al método Kjeldahl para la determinación de nitrógeno total, entregando ambos métodos, un valor confiable de nitrógeno total. Por otra parte, dependiendo de la muestra del alimento y del momento en que se realice el análisis la diferencia puede variar entre 1 a 3% favorable a Dumas. En otras palabras, si se realiza un análisis foliar y su resultado de nitrógeno arroja un 2,5% con la metodología Dumas, en el peor de los casos, en Kjeldahl, se obtendría un 2,4% aproximadamente (Simonne et al. 1997, Etheridge et al. 1998, Miller et al. 2007).

No existen diferencias significativas entre los análisis realizados mediante el método Kjeldahl y el método de Dumas, lo que demuestra que ambos procedimientos entregan resultados de nitrógeno total comparables para las diferentes matrices de muestras evaluadas. Tomando en cuenta que los análisis de determinación de nitrógeno en el laboratorio de análisis físico químico del Instituto Nacional de Nutrición (así como en cualquier otro laboratorio de análisis de alimentos) son de orden rutinario, además de todas las ventajas expuestas en esta investigación, se recomienda emplear el método Dumas como una alternativa para determinación de proteínas totales empleando el factor de conversión adecuado para cada alimento.