tipTIP. Revista especializada en ciencias
químico-biológicasTIP1405-888XUniversidad Nacional Autónoma de México, Facultad de Estudios
Superiores Zaragoza0000810.22201/fesz.23958723e.2021.305Artículos originalesEstudio de caso: evaluación y efecto del alimento con oxitetraciclina
preparado industrialmente y con un procedimiento establecido en granja sobre el
desarrollo del camarón Penaeus vannamei y su acumulación en
músculo y hepatopáncreasCase study: Evaluation and effect of feed with oxytetracycline
industrially prepared and with a farm-based procedure on the development of
Penaeus vannamei shrimp and its accumulation in muscle
and hepatopancreasGámez-BayardoSergio1Espinosa-PlascenciaAngelica1Jiménez-EdezaMaribel2Pérez-ÁlvarezAdolfo3García-GalazAlfonso1Bermúdez-AlmadaMaría del Carmen1*Centro de Investigación en Alimentación y
Desarrollo, A.C. (CIAD, A.C.). Coordinación de Ciencia de los Alimentos,
Laboratorio de Análisis Biológicos. Carretera Gustavo Enrique Astiazarán Rosas #
46, Col. La Victoria, Hermosillo 83304 Sonora, México. Centro de Investigación en Alimentación y
Desarrollo A. C.Centro de Investigación en Alimentación y
Desarrollo, A.C.HermosilloSonoraMéxicoUniversidad Autónoma de Sinaloa, Laboratorio de
Investigación y Diagnóstico Microbiológico, Facultad de Ciencias Químico
Biológicas. Culiacán 80013, Sinaloa.Universidad Autónoma de SinaloaUniversidad Autónoma de SinaloaFacultad de Ciencias Químico
BiológicasLaboratorio de
Investigación y Diagnóstico MicrobiológicoCuliacánSinaloaMéxicoGranja Acuícola Maricultura del Pacífico.
Hermosillo 83240, Sonora, México.Granja Acuícola Maricultura del
PacíficoGranja Acuícola Maricultura del
PacíficoHermosilloSonoraMéxicoE-mail: *cbermudez@ciad.mx202124e3051607202023032021Este es un artículo publicado en acceso abierto bajo una licencia
Creative CommonsResumen
La investigación consistió en comparar dos métodos de adición de oxitetraciclina
(OTC) en el alimento para camarón, así como el efecto en su desarrollo y en la
acumulación en músculo y hepatopáncreas de Penaeus vannamei. Se
realizó un bioensayo durante 30 días empleando 180 camarones juveniles
utilizando dos formulaciones para alimentarlos con (OTC-1 y OTC-2). Los
alimentos medicados se administraron durante 14 días, posteriormente se les dio
alimento sin antibiótico por 16 días más, y se determinó la calidad
fisicoquímica del agua. En los camarones se evaluó lo siguiente: parámetros
biológicos y fisiológicos, acumulación (Cmáx ) de OTC y tiempo de eliminación en el músculo y hepatopáncreas
determinada por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). El desarrollo
de los organismos mostró una sobrevivencia de 99.72% para OTC-1 y
100% para OTC-2. La Cmáx de OTC en el músculo del grupo OTC-1 fue de 16.09 ± 1.80
µgg-1 y en el de OTC-2, 6.62 ± 0.87 µgg-1; en el
hepatopáncreas fue de 105.85 ± 17.56 µgg-1 con (OTC-1) y 79.16 ±
15.61 µgg-1 con (OTC-2), encontrando una asociación en la Cmáx de OTC respecto al método de adición (p ≤ 0.05). El alimento medicado
mediante un proceso industrial con (OTC-1) y el adicionado con OTC en granja
(OTC-2) requieren mayor control de calidad para asegurar la concentración del
antibiótico deseada, antes de su administración en los cultivos de camarón.
Abstract
This research consisted of comparing two methods of adding oxytetracycline (OTC)
in shrimp feed, as well as its development and its accumulation in muscle and
hepatopancreas from Penaeus vannamei. A bioassay was carried
out for 30 days using 180 juvenile shrimp testing two formulations to feed the
organisms (OTC-1 and OTC-2). The formulations medicated were administered 14
days, and subsequently they were fed with a diet without antibiotic for 16 more
days and water quality was determinate by physicochemical data. In shrimps the
following was evaluated: Biological and physiological parameters, accumulation (Cmáx ) of OTC and elimination time in muscle and hepatopancreas were
determined by high performance liquid chromatography (HPLC). The development of
organisms showed a survival of 99.72% for OTC-1 and 100% for OTC-2.
The Cmáx of OTC in muscle for the OTC-1 group was 16.09 ± 1.80 µgg-1 and the OTC-2
group was 6.62 ± 0.87 µgg-1; in the hepatopancreas it was 105.85 ±
17.56 with (OTC-1) and 79.16 ± 15.61 µgg-1 with (OTC-2) finding an
association of Cmáx of OTC by the method of addition (p ≤ 0.05). The medicated shrimp feed
through an industrial process (OTC-1) and the addition on the farm (OTC-2)
require greater quality control to ensure the desired concentration of the
antibiotic, before its administration in shrimp cultures.
En países con alta producción de cultivo de camarón Penaeus
vannamei, el uso de antibióticos incluidos en el alimento sigue siendo una
práctica común sin restricción (Lunestad, Hannisdal
& Samuelsen, 2015). La información sobre el tipo y dosis de
antibióticos utilizados en la acuicultura en el mundo es escasa. La oxitetraciclina
(OTC) es uno de los tres antibióticos aprobados para su uso en la acuicultura de
peces, de acuerdo a la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados
Unidos por sus siglas en inglés (FDA), para tratar enfermedades causadas por
bacterias con capacidad patogénica (Vorbach,
Chandesana, Derendorf & Yanong, 2019). En el caso de México, los
antibióticos más utilizados en la acuicultura, específicamente en el cultivo de
camarón P. vannamei son, oxitetraciclina (OTC), florfenicol (FFC) y
enrofloxacina (ENRO). Estos antibióticos han demostrado su eficacia en el
tratamiento de vibriosis y de infecciones causadas por cocos Gram positivos y
bacilos Gram negativos (Soto-Rodríguez, Gómez-Gil,
Roque & Lozano, 2008; Lara-Espinoza,
Espinosa-Plascencia, Rivera-Domínguez, Astorga- Cienfuegos & Acedo-Félix,
2015).
El uso de alimentos suplementados con vitaminas, proteínas adicionales y compuestos
que promuevan el crecimiento de los organismos en cultivo, ha sido implementado en
los últimos años. La generación de nuevas formulaciones de alimentos es una
alternativa con la finalidad de prevenir posibles enfermedades que puedan afectarlos
estando en cultivo, sin alterar las condiciones fisicoquímicas y ambientales para su
crecimiento y sin afectar la relación costo-producción (Zhou, Thirumurugan, Wang, Lee & Davis, 2016). Las fábricas
de alimentos balanceados formulan alimento para camarón con altos estándares de
calidad, con la finalidad de prolongar su vida de anaquel y mantener sus propiedades
nutracéuticas. Dentro de la relación costo-producción, el alimento utilizado con los
nutrientes y suplementos necesarios para el óptimo crecimiento de los organismos en
cultivo, representa uno de los mayores costos de producción para
los acuicultores (O´Keefe & Campabadal,
2015), principalmente las dietas adicionadas con antibióticos, debido a
su proceso de manufactura. En este sentido, la porción no consumida del alimento
(60-70%) se descompone por hidratación, reduciendo su actividad química, biológica y
microbiológica (Fox, Treece & Sánchez,
2001). Factores como la solubilidad en el agua, la afinidad de las
partículas orgánicas a quelarse y la fotodegradación, influyen en la persistencia de
la OTC en los sistemas de cultivo, lo que favorece el desarrollo de resistencia a
las bacterias que los habitan (Samuelsen et
al., 2015).
La información que existe acerca de las prácticas empleadas en las granjas acuícolas
sobre el manejo del alimento es escasa y es un aspecto que no está legislado. Los
procedimientos para la adición de antibióticos, las condiciones de almacenamiento y
el manejo de los alimentos medicados generalmente se implementan con base en el
criterio del responsable técnico de la granja. Una práctica común en las unidades
acuícolas es adicionar el antibiótico a un alimento comercial, empleando
procedimientos con poca estandarización y control. Uno de estos procedimientos
consiste en agregar el antibiótico en solución a través de un atomizador sobre el
alimento comercial, o mezclarlo con el alimento y agitarlo por un corto tiempo.
Estos procedimientos no cuentan con un control de calidad que garantice la
homogenización del fármaco y la concentración final deseada de éste en el alimento,
antes de su aplicación en los estanques de cultivo. Lo anterior, aunado a la escasez
de investigaciones que proporcionen información relevante sobre las implicaciones
que tiene la forma de adicionar el antibiótico en el alimento, su acumulación en los
tejidos y su efecto en el control de lesiones internas y externas en el camarón
P. vannamei, genera interés científico debido al desarrollo de
resistencia bacteriana, principalmente en bacterias del género
Vibrio, que son causantes de altas mortalidades de
camarón. Por ello, en esta investigación se planteó evaluar dos
procesos de adición de la OTC en el alimento para camarón, a fin de determinar su
acumulación en los tejidos y el impacto en algunos parámetros biológicos y
fisiológicos de P. vannamei.
Materiales y métodosComposición química del alimento para camarón
Los alimentos adicionados con OTC y sin OTC fueron de origen comercial,
preparados de acuerdo a los requerimientos nutricionales específicos para
camarón. La composición química del alimento se muestra en la Tabla I.
Composición del alimento comercial para camarón.
Ingredientes
Porcentaje (%)
Harina de pescado
26.20
Harina de soya
25.00
Gluten de maíz
6.00
Aceite de pescado
2.03
Lecitina de soya
2.03
Mezcla vitamínica
0.50
Vitamina C
0.05
Aglutinante
0.80
Fosfato monobásico
4.36
Metionina
0.02
Adición de oxitetraciclina en los alimentos para camarón
Se utilizaron dos alimentos con distinto método de adición de OTC (OTC-1 y
OTC-2). Para OTC-1, el antibiótico se adicionó en una fábrica de alimentos para
producción animal, empleando el protocolo de fabricación estandarizado en la
empresa. En el caso de OTC-2, la adición de OTC en el alimento se realizó
siguiendo el protocolo establecido en la granja camaronícola, utilizando un
alimento comercial para camarón libre de antibióticos. Para este procedimiento
se preparó una solución de OTC (Sigma Aldrich, EUA) a una concentración de 8,000
mg L-1, disolviendo 8 g de OTC en 250 mL de agua de mar estéril, y
esta solución se adicionó a 1 kg de alimento. Para su homogenización se utilizó
una revolvedora mecánica (Cipsa Ultra 10) con motor Honda de 9 hp, mezclando
durante 15 min, obteniendo el alimento impregnado con la solución del
antibiótico. Ambos alimentos se prepararon para tener una concentración final de
8,000 mg Kg-1 de OTC.
Análisis de oxitetraciclina en los alimentos para camarón
La concentración de la OTC en los alimentos OTC-1 y OTC-2 se determinó previo a
su administración a los organismos, empleando para el análisis un método de
cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) con detección ultravioleta,
siguiendo el procedimiento descrito por Houglum,
Larson & Knutson (1997). Previamente se realizó el análisis de
OTC en el alimento comercial para confirmar que estaba libre de antibióticos.
Los análisis de las muestras de alimento se realizaron por duplicado incluyendo
en cada corrida analítica, un control negativo (alimento sin antibióticos) y uno
positivo (alimento adicionado con OTC a una concentración conocida).
Diseño experimental del bioensayo
Se realizó un bioensayo en una granja acuícola ubicada en Bahía de Kino, Sonora,
México (28° 48’ 57.1” N 111° 54’ 32.6” W) durante un período de 30 días. Se
emplearon 180 camarones juveniles de la especie P. vannamei que
fueron tomados al azar de los estanques de la granja acuícola y colocados en
peceras de 40 L, registrando su peso inicial.
Los organismos se distribuyeron en tres grupos (OTC-1, OTC-2 y grupo control).
Cada grupo estuvo conformado por seis peceras con 20 organismos por pecera.
Los alimentos con OTC (OTC-1 y OTC-2) se administraron a dos grupos de
organismos, en dos fases: una primera de tratamiento de 14 días; y
posteriormente una segunda de eliminación del antibiótico en la que se
administró a ambos grupos de organismos alimento sin antibiótico por 16 días.
Los organismos del grupo control se alimentaron con una dieta sin antibiótico
durante todo el bioensayo. La tasa de alimentación fue al 4% de la biomasa, y se
administró 30% del alimento por la mañana, 30% en la tarde y 40% en la noche, de
acuerdo al protocolo de alimentación para organismos en etapa de engorde
implementado en la granja acuícola.
Se evaluó dos veces al día la calidad del agua mediante la medición de parámetros
fisicoquímicos como, pH, temperatura, oxígeno disuelto (OD) y salinidad. Los
niveles de nitrógeno amoniacal total (NAT) y la alcalinidad expresada como
CaCO3 se cuantificaron una vez a la semana. Todas las peceras se
mantuvieron con aireación constante. El alimento no consumido por los
organismos, la colección de mudas y la materia orgánica y fecal se eliminaron
diariamente mediante sifoneo, y se realizó recambio de agua de las peceras al
80%, una vez a la semana.
Determinación de los parámetros biológicos en los camarones
Al inicio del bioensayo los organismos se pesaron en una balanza analítica
digital Scout Pro 400 g EMAUS (México) y se midieron desde la parte proximal del
rostro hasta el telson, empleando un vernier Foy con escala milimétrica
(Querétaro, México). Durante el periodo del bioensayo (30 días) se realizaron
muestreos cada tercer día, tomando tres camarones de cada pecera, los cuales se
pesaron y midieron, registrando los datos para calcular la ganancia de peso, el
incremento en talla, el porcentaje de sobrevivencia de los organismos, la Tasa
Específica de Crecimiento (TEC) y el Factor de Conversión Alimenticia (FCA).
Todas las ecuaciones correspondientes a estas mediciones se muestran en la Table II.
Ecuaciones utilizadas en el cálculo de los parámetros biológicos
de crecimiento del camarón <italic>Penaeus
vannamei.</italic>
Determinación de las lesiones externas e internas en los camarones
La evaluación de las lesiones externas e internas en los organismos se realizó
aplicando los criterios establecidos por Lightner (1996). La valoración de las lesiones externas se realizó
tomando cada tercer día un camarón de cada pecera. Se registraron los cambios de
coloración en la cutícula y/o pleópodos y pereiópodos, deformaciones en el
rostro, exoesqueleto y necrosis o melanización en la cutícula, posteriormente se
hizo la evaluación de las lesiones internas, extrayendo de cada organismo las
branquias, intestino, ciego y hepatopáncreas (HP), observando estos órganos en
fresco al microscopio (Nikon Eclipse E200, EUA). En las branquias se determinó
la presencia de necrosis, ectoparásitos y bacterias filamentosas, en
hepatopáncreas el daño en túbulos, contenido de lípidos y en intestino y ciego
la presencia de gregarinas y gametocitos. Se utilizaron los criterios propuestos
por Lightner (1996) para estimar las lesiones observadas al microscopio en los
distintos órganos del camarón, utilizando una escala con valores categóricos de
cero a cuatro, dependiendo del grado de severidad de las lesiones en los
distintos órganos (0 = no existe lesión en el órgano y 4 = daño severo).
Para estimar el contenido de lípidos en el hepatopáncreas se consideraron los
criterios descritos por Tapia-Salazar et
al. (2012), utilizando una escala de L0 a L4, siendo L4
= 76-100% de los túbulos llenos de vacuolas de lípidos; L3 = 51-75% de lípidos;
L2 = túbulos con moderada cantidad de lípidos (26- 50% del nivel L4), L1 =
escasa cantidad de lípidos (10% del nivel L4) y L0 = nula presencia de vacuolas
de lípidos (< 10% del nivel L4).
Aseguramiento de la calidad de los datos
El método utilizado para la cuantificación de oxitetraciclina por HPLC fue
desarrollado tomando como base la metodología publicada por Bermúdez-Almada, Pérez- Tello, Valenzuela-Quintanar
& Vázquez-Moreno (1999) y validado en un estudio previo de
nuestro grupo de trabajo (Espinosa-Plascencia,
López-Arvayo, González- Carrillo & Bermúdez-Almada, 2012), con el
propósito de establecer los parámetros de desempeño y compararlos con las
especificaciones de validación de métodos analíticos (USDA, 1987). Los parámetros de desempeño del método
empleado fueron: linealidad (r2 = 0.9999); límite de detección (0.01
µgmL-1); límite de cuantificación (0.05 µgg-1);
exactitud (91.5 ± 12.7% de recuperación para músculo y 90.1 ± 17.3% para
hepatopáncreas).
Determinación de la acumulación de oxitetraciclina en los tejidos de los
camarones
La extracción de OTC de músculo y hepatopáncreas de los camarones se realizó
siguiendo la metodología reportada por Gómez-Jiménez, Espinosa-Plascencia, Valenzuela-Villa & Bermúdez-Almada
(2008). La eliminación de lípidos y compuestos cromóforos
interferentes de las muestras se hizo utilizando 10 mL de hexano grado reactivo
(Sigma- Aldrich, EUA) en músculo y 16 mL en hepatopáncreas. La elución de OTC se
llevó a cabo con 15 mL de una mezcla de acetonitrilo:metanol (1:1 v/v) con 0.06%
(p/v) de butilhidroxianisol (BHA) y butilhidroxitolueno (BHT) (Sigma-Aldrich,
EUA). El extracto obtenido se llevó a sequedad total en un baño de agua (VWR
Scientific Products, EUA) a 40 °C, con un flujo de aire constante.
Las muestras secas se resuspendieron en 1 mL de una mezcla de ácido oxálico 0.02
M:acetonitrilo:metanol (70:27:3 v/v/v), y se agitaron a alta velocidad por 30 s
en un vórtex. Posteriormente, las muestras fueron sometidas a un proceso de
sonicación por 30 min (Sonicador Cole Parmer, Chicago, IL.) y se centrifugaron a
2,800 g por 15 min a 4 °C (Heraeus Megafuge 8 Benchtop Thermo Scientific, EUA).
Las muestras se filtraron usando acrodisc con tamaño de poro de 0.20 µm
(Acrodisc LC13 PVDF), y 200 µL del extracto se inyectaron en el cromatógrafo de
líquidos de alta resolución (HPLC) Varian Prostar 210, utilizando el programa
Galaxie Chromatography Data System Versión 1.9 (Varian Co. Walnut Creek, CA.
EUA). El HPLC fue conectado a un detector UV-Vis Prostar 325 programado a una
longitud de onda de 365 nm. Se utilizó una columna nucleosil C18 de 150 x 4.6 mm
con tamaño de partícula de 5 µm (Supelco, Co., St. Louis, MO. EUA) y la fase
móvil consistió en una mezcla de ácido oxálico 0.02 M:acetonitrilo:metanol
(70:27:3 v/v/v) a un flujo isocrático de 1 mL min-1. El tiempo de corrida fue de
7 min.
Análisis estadístico
El análisis de los datos obtenidos en la medición de los parámetros
fisicoquímicos del agua de las peceras, y de las evaluaciones biológicas y
fisiológicas de los organismos se realizó mediante estadística descriptiva
(media y desviación estándar). Se determinó una correlación entre los datos de
acumulación de OTC y el desarrollo biológico de los organismos mediante una
prueba de Pearson. Adicionalmente, se determinaron en los parámetros de FCA y
TEC las diferencias significativas mediante un análisis de varianza de una vía.
Los datos obtenidos de la acumulación de OTC en músculo y hepatopáncreas de los
camarones fueron evaluados mediante un análisis de varianza de una vía en cada
uno de los puntos de muestreo. Un valor de p ≤ 0.05 se consideró
estadísticamente significativo.
ResultadosConcentración de oxitetraciclina en alimento para camarón
El análisis de los alimentos con OTC-1 y OTC-2 mostró que la concentración de OTC
en ambos fue menor al nivel teórico del antibiótico (8,000 mg Kg-1).
El alimento con (OTC-1) fabricado en la planta de alimentos balanceados tuvo una
concentración de 4,684.38 mg Kg-1 del antibiótico y el alimento
adicionado con OTC en la granja (OTC-2) presentó una concentración de 776.81 mg
Kg-1.
Parámetros fisicoquímicos
Durante el bioensayo, el valor más bajo registrado en la temperatura del agua de
las peceras fue de 29.3 ± 0.7°C por la mañana y el más alto de 34.8 ± 1.6°C por
la tarde, permaneciendo en promedio una temperatura de 31.70 ± 2.25 ºC. El
oxígeno disuelto (OD) presentó el valor más bajo de 3.6 ± 1.0 mgL-1 y
el más alto de 5.8 ± 0.4 mgL-1. La salinidad mínima registrada de
forma semanal en el agua de las peceras fue de 34.6 ± 7.3 ‰ y el valor máximo
fue de 40.8 ± 2.4 ‰. La salinidad promedio durante el bioensayo fue de 37.97 ±
0.53 ‰, mostrando los organismos una buena adaptación a estas condiciones. Los
valores de los parámetros fisicoquímicos obtenidos durante todo el bioensayo se
presentan en la Tabla III.
Parámetros fisicoquímicos del agua de mar utilizada en el bioensayo con camarón <italic>Penaeus vannamei</italic> tratado con alimento al que se le adicionó oxitetraciclina.
Parámetros biológicos en los camarones
En los organismos tratados con el alimento OTC-1, la ganancia de peso fue de 1.16
± 0.89 g, siendo mayor a la que mostró el grupo de organismos que recibieron el
alimento OTC-2 y el grupo control, que fue de 0.69 ± 0.18 y 0.73 ± 0.04 g
respectivamente. En relación a la talla, se encontró que en el grupo tratado con
el alimento OTC-1 se tuvo un incremento de 4.40 ± 1.83 mm, observándose valores
superiores a los mostrados por los grupos tratados con el alimento OTC-2, que
fue de 3.03 ± 1.55 mm y en el grupo control, que fue de 2.98 ± 1.69 mm. El
desarrollo de los organismos durante el bioensayo se consideró adecuado en todos
los grupos de tratamiento. Los resultados de la evaluación biológica de los
camarones que conformaron los grupos estudiados se muestran en la Tabla IV. No se encontraron diferencias
significativas entre los valores obtenidos de TEC y FCA respecto a los alimentos
administrados durante todo el bioensayo (p ≥ 0.05). La ganancia de peso promedio
semanal fue de 0.60 ± 0.53 g y el crecimiento acumulado de 0.07 ± 0.01 mm para
los tres grupos. En este sentido, se determinó la relación de la concentración
de OTC en los tejidos de camarón frente a parámetros como peso y talla mediante
la prueba de Pearson. El análisis de los datos aplicando esta prueba estadística
demostró que el alimento OTC-2 presentó una asociación entre la concentración
del antibiótico y el incremento en la talla (p ≤ 0.05), mientras que en los
camarones alimentados con OTC-1 no se observó esta asociación en peso y talla,
los resultados de la asociación se muestran en la Tabla V. Entre los aspectos de gran importancia que no se
deben perder de vista se puede señalar, que el uso de alimentos con antibiótico
propicia la contaminación de los estanques, generación de residuos de
antibióticos en los tejidos de los organismos y el desarrollo de resistencia
bacteriana.
Parámetros biológicos en camarón <italic>Penaeus vannamei</italic> tratado con distintos alimentos a los que se les adicionó oxitetraciclina<italic>.</italic>
FCA: Factor de Conversión Alimenticia; TCE: Tasa de Crecimiento Específico.
Correlación de Pearson en la acumulación de oxitetraciclina en
los tejidos del camarón <italic>Penaeus vannamei</italic> y
parámetros biológicos.
TCE: Tasa de Crecimiento Específico; *Valor de p ≤ 0.05.
La sobrevivencia de los organismos tratados con el alimento OTC-1 fue de 99.72 %,
para los que recibieron el tratamiento OTC-2 y el grupo control fue de 100%.
Estadísticamente se demostró que no hubo diferencia significativa en la
sobrevivencia de los organismos con respecto a los tratamientos
administrados.
Evaluación de lesiones internas y externas en los camarones
Se encontró que los organismos no presentaron lesiones externas en los grupos
OTC-1, OTC-2 y el control, esto se atribuyó al bajo número de camarones
colocados en cada pecera, lo que evitó el hacinamiento. La observación de
lesiones internas en el intestino de los organismos evaluados de los grupos
OTC-1 y OTC-2, mostró la presencia de gregarinas en el 1.11% del total de los
organismos, y no se observaron gametocitos. Uno de ellos presentó quistes de
parásitos en la región del ciego; los camarones pueden alojar estos parásitos
dependiendo del entorno en que se cultivan. La Figura 1 muestra fotografías microscópicas de órganos de camarón de
los grupos tratados con los alimentos medicados (OTC-1 y OTC-2), no observándose
diferencias entre ambos grupos y con respecto al control. En el hepatopáncreas,
se observaron los túbulos con un adecuado contenido de lípidos en el 95% de los
organismos; las branquias no presentaron ectoparásitos o bacterias filamentosas;
solo se detectó necrosis en el 1.94% de los camarones. El resto de los
organismos analizados presentaron mínimas lesiones externas e internas. En la
microscopía correspondiente al intestino se observa un gran número de compuestos
cromóforos y ausencia de parásitos, y en la región del ciego se aprecia la
ausencia de quistes.
Microscopía 40x de distintos órganos del camarón <italic>Penaeus
vannamei</italic>, para la evaluación de lesiones internas.
(A)Túbulos del hepatopáncreas. (B) Branquias del camarón. (C)
Sección del intestino del camarón. (D) Sección del ciego del
intestino del camarón. Elaboración personal.
Concentración de oxitetraciclina en los tejidos de camarón<italic>Penaeus vannamei</italic>
Los niveles de acumulación de OTC en músculo y hepatopáncreas, así como el tiempo
requerido para su eliminación de los tejidos se presentan en las Tablas VI y VII. En las muestras del grupo OTC-1, la concentración máxima (Cmáx ) de OTC en músculo se obtuvo al noveno día de tratamiento y en
hepatopáncreas al décimo día. Mientras que en el grupo de organismos que
recibieron el alimento OTC-2, la Cmáx se alcanzó el décimo día, tanto en músculo, como en hepatopáncreas. Se
observó que la acumulación de OTC en el músculo de los organismos que recibieron
el alimento OTC-2 presentó diferencias significativas en los primeros seis
muestreos (p ≤ 0.05), en comparación con la acumulación del antibiótico que se
obtuvo en el grupo que recibió el alimento OTC-1. Mientras que en el
hepatopáncreas la concentración de OTC reflejó diferencias significativas
únicamente en el muestreo ocho, correspondiente al día 24 del tratamiento, al
comparar ambos grupos. Durante la etapa de retiro del antibiótico, en ambos
tejidos evaluados se encontró que la eliminación fue más eficiente en los
organismos que recibieron el tratamiento con OTC-1 comparado con el tratamiento
OTC-2 (Tablas VI y VII).
Acumulación de oxitetraciclina en músculo del camarón
<italic>Penaeus vannamei.</italic>
ND: No detectado.
Acumulación de oxitetraciclina en el hepatopáncreas del camarón
<italic>Penaeus vannamei.</italic>
Tejido
Muestreos
Alimentos
Cmáx (µgg-1)
ANOVA *p (≤ 0.05)
1
OTC-1
3.73 ± 0.74
p ≥ 0.05
OTC-2
3.83 ± 0.54
2
OTC-1
69.22 ± 3.44
p ≥ 0.05
OTC-2
50.23 ± 1.87
3
OTC-1
104.24 ± 13.01
p ≥ 0.05
OTC-2
71.63 ± 4.22
4
OTC-1
105.85 ± 17.56
p ≥ 0.05
OTC-2
79.46 ± 15.61
Hepatopáncreas
5
OTC-1
1.78 ± 0.28
p ≥ 0.05
OTC-2
2.67 ± 0.87
6
OTC-1
1.52 ± 0.15
p ≥ 0.05
OTC-2
2.75 ± 0.61
7
OTC-1
ND
p ≥ 0.05
OTC-2
0.85 ± 0.18
8
OTC-1
ND
p ≤ 0.05
OTC-2
0.07 ± 0.01
9
OTC-1
ND
-
OTC-2
ND
ND: No detectado.
Durante la etapa posterior al tratamiento con OTC, los organismos tratados con
los alimentos OTC-1 y OTC-2 requirieron quince días para la eliminación del
antibiótico del músculo; mientras que para la eliminación en el hepatopáncreas
se requirieron doce días en el grupo que recibió el alimento OTC-1 y quince días
en los organismo tratados con el alimento OTC-2 (Tablas VI y VII). Es decir,
que después de esos tiempos el antibiótico ya no estaba presente o bien se
encontraba por debajo del límite mínimo de detección (0.01 µgmL-1)
establecido en este estudio para el método analítico. Estadísticamente no se
observó diferencia significativa entre los grupos OTC-1 y OTC-2, en las
concentraciones de OTC acumuladas durante el período de retiro del
antibiótico.
Discusión
La finalidad de formular un alimento con una concentración adecuada de antibiótico es
la de aplicar una terapia apropiada en los cultivos de camarón, cuando se requiere
contener un brote infeccioso por patógenos emergentes bacterianos. Sin embargo, para
obtener un alimento medicado que contenga la concentración deseada de antibiótico se
deben cumplir ciertos requisitos. Entre los factores que influyen en la
incorporación adecuada de antibiótico está su composición y la cantidad de los
suplementos que integran la formulación del alimento. Además de la forma, tamaño y
densidad de las partículas, la presencia de ingredientes líquidos, el peso de los
ingredientes y su homogeneización así como el orden en el que éstos son mezclados,
son factores que contribuyen a que el antibiótico pueda no ser distribuido
correctamente o no se mantenga estable dentro del alimento. Además, existen factores
externos como la temperatura y la humedad durante el almacenamiento, los niveles de
CO2, presencia de hongos e insectos, que pueden alterar la naturaleza
del alimento (FDA, 1994).
La diferencia en la concentración de la OTC teórica y la determinada analíticamente
en el alimento OTC-2, demostró que el procedimiento de adición del antibiótico
empleado en la granja no fue el adecuado, provocando que éste no se incorporara
correctamente y tuviera una concentración menor al 10% del nivel teórico calculado.
En el caso del alimento preparado industrialmente (OTC-1), también se observó que la
adición del antibiótico no fue eficiente dado que sólo se recuperó el 58% de la
concentración adicionada. Si se considera que el alimento representa entre el 50 y
70% de los costos de producción en el cultivo de camarón, es importante garantizar
que este sea lo más eficiente posible (Faillace,
Vergara & Suárez, 2016).
El preparar alimentos con antibiótico en las granjas de cultivo de camarón con el
propósito de controlar las infecciones bacterianas es una práctica común que se
lleva a cabo en la industria acuícola, y que tiene como finalidad reducir los costos
de producción. Sin embargo, estos alimentos pueden no contener la concentración
adecuada del antibiótico, o presentar irregularidad en el tamaño de las partículas,
y no ser uniforme, lo que incrementa el riesgo de que el antibiótico sea lixiviado
en el agua de los estanques. Aunado a esto, la administración de alimentos
suplementados con antibiótico en dosis subterapéuticas puede provocar el desarrollo
de resistencia bacteriana en patógenos emergentes, e incrementar el índice de
mortalidad de los camarones en cultivo, debido al nulo efecto de los tratamientos
con antibióticos ante una infección bacteriana (Achupallas, Zhou & Davis, 2016).
Por ello, se considera la alimentación de los organismos en cultivo como uno de los
factores más importantes involucrados en su producción, que debe mantenerse bajo una
observación cuidadosa y permanente (Achupallas,
2000). Es recomendable llevar a cabo el análisis del alimento adicionado
con el antibiótico y sin antibiótico, empleando métodos confiables para confirmar la
concentración indicada, o bien, la ausencia de antibióticos en el alimento. Un
deficiente control de calidad durante la fabricación del alimento para camarón puede
ocasionar que alimentos sin medicar presenten residuos de antibióticos, o bien un
nivel mayor o menor del antibiótico en los alimentos adicionados (González-Carrillo, Espinosa-Plascencia & Bermúdez-
Almada, 2010).
Una de las principales limitaciones que impiden asegurar la concentración correcta de
los antibióticos en el alimento para camarón es la falta de metodologías analíticas
suficientemente sensibles y confiables para la identificación y cuantificación de
estos compuestos durante su proceso de elaboración y en el producto terminado. El
empleo de metodologías analíticas validadas, como HPLC en la determinación de la OTC
en el alimento para camarón, es una herramienta que proporciona buenos resultados,
por la sensibilidad y precisión en la detección de este antibiótico en matrices
complejas como lo es el alimento para camarón. Esta metodología analítica puede
contribuir a mantener un mejor control de calidad en el alimento destinado a
especies acuáticas en cultivo, para que su aplicación sea segura, sin causar
contaminación en los ecosistemas y el desarrollo de resistencia bacteriana (González et al., 2010).
En relación a los parámetros fisicoquímicos durante el cultivo, Li et al. (2008) y Burbano-Gallardo et al. (2015) expusieron que
P. vannamei es una especie capaz de resistir intervalos de
salinidad de 1-50 ‰, sin que se afecte su desarrollo, lo cual se pudo constatar en
este estudio, donde tuvieron un adecuado desarrollo a una salinidad promedio de
37.97 ± 0.53 ‰. Las altas salinidades causan estrés y obligan al camarón a utilizar
recursos energéticos para restablecer el equilibrio osmótico causado por la
diferencia de osmolaridad entre los fluidos internos del organismo y el agua marina
(Yohenia & Bolaños, 2013). En este
estudio los parámetros fisicoquímicos que prevalecieron en el agua de las peceras no
mostraron mayores diferencias al compararlos con los valores reportados por otros
autores, quienes los señalan como óptimos para el desarrollo y sobrevivencia de
P. vannamei (Tabla
III).
Torres & Zaragoza (2002) reportaron que
los antibióticos promueven el crecimiento de los camarones porque modifican
cuantitativa y cualitativamente la microbiota intestinal. Esto ocurre debido a que
las bacterias patógenas y la microbiota normal del intestino se ven disminuidas por
la acción del antibiótico, reflejándose esto en una mayor efectividad de absorción y
asimilación de los nutrientes, generando una mejor conversión del alimento en
biomasa y aumento de la talla de los organismos. La calidad del alimento y la
cantidad ingerida influye en el peso y tamaño, ya que este provee los nutrientes
necesarios para su óptimo desarrollo, como lo mencionan Zhou et al. (2016). En este sentido, el factor
de conversión alimenticia es uno de los indicadores más importantes en la producción
de camarón, ya que permite conocer si se alimentan y desarrollan adecuadamente.
Boyd et al. (2000) reportaron
que el FCAdebe mantenerse entre 1.5-2.0, para tener un adecuado crecimiento de los
organismos, y sus requerimientos energéticos y proteicos cubiertos. Mientras que
otros autores mencionaron que en camarones P. vannamei alimentados
con dietas con aditivos, un FCA en el rango de 1.22 ± 0.12 a 1.29 ± 0.11 puede ser
adecuado (Apun- Molina et al.,
2015; Carvalho, Haruo-Ota, Kadry, Tacon
& Lemos, 2016). Los resultados obtenidos en el FCA de este estudio
fueron cercanos a los valores recomendados por estos autores, y la diferencia pudo
ser atribuida a la variabilidad en el peso inicial de los organismos juveniles
empleados, que fue de 2.45 a 5.91 g. Mientras que Fóes, Krummenauer, Lara, Poersh & Wasieslesky (2016) señalaron que
la administración de alimento con antibióticos mejora el FCA a largo plazo. Bajo las
condiciones establecidas en el bioensayo, los parámetros de ganancia de peso,
crecimiento, FCA y sobrevivencia se consideraron adecuados en los grupos tratados
con alimentos adicionados con OTC y los valores fueron superiores a los del grupo de
control administrado con alimento sin antibiótico.
La alta sobrevivencia obtenida en el bioensayo, que fue de 99.8 y 100% para los
grupos OTC-1 y OTC-2 respectivamente, pudo ser el resultado de la baja densidad de
organismos que se mantuvieron en las peceras y el haberlos elegido para este ensayo
en la etapa juvenil que es cuando están mejor adaptados a las condiciones
ambientales. Los porcentajes de sobrevivencia fueron adecuados y superiores a los
obtenidos por otros autores en bioensayos con condiciones similares, donde se
reportan valores de sobrevivencia menores al 90% en camarón P.
vannamei (Gutiérrez-Dagnino et
al, 2015; Fóes et
al., 2016).
Gong, Jiang, Lawrence, González-Félix &
Pérez-Velázquez, (2004) reportaronquepara P. vannamei
loslípidosalmacenados en el hepatopáncreas, representan una reserva suficiente de
energía que podrá ser utilizada durante la exposición a condiciones externas, por
ello es importante que se mantenga un nivel adecuado de lípidos en este órgano.
Tapia-Salazar et al.
(2012) reportaron que la atrofia en los túbulos del hepatopáncreas se
relaciona directamente con la presencia de infecciones bacterianas. Otro estudio
realizado por Cuartas, Díaz & Petriella
(2002) reportaron que las deformaciones de los túbulos, inflamación y
aumento de la actividad celular en estos pueden ser causadas por estrés nutricional,
presencia de patógenos o alteraciones del medio ambiente. Sin embargo, en nuestro
estudio no se observaron manifestaciones de atrofia severa en los túbulos, por lo
que se descartó una infección bacteriana y el desarrollo de los organismos en el
bioensayo fue óptimo.
El diagnóstico oportuno de lesiones internas o externas en los organismos ocasionadas
por bacterias, favorece la correcta aplicación de terapias y dosis adecuadas de
antibióticos. Durante la etapa de tratamiento en el bioensayo, donde se administró
el alimento con antibiótico, la concentración de la OTC en los distintos tejidos
(músculo y hepatopáncreas) presentó variaciones, esto fue debido al crecimiento de
los organismos, ya que durante esta etapa ocurrieron procesos de muda y los
camarones dejan de alimentarse, lo que provoca cambios en su metabolismo y actividad
celular, reflejándose en las variaciones obtenidas en la acumulación de OTC en los
tejidos (Uno, Aoki, Kleechaya, Tanasomwang &
Ruangpan, 2006; Bermúdez-Almada,
Espinosa-Plascencia, Santiago- Hernández, Barajas-Borgo & Acedo-Félix,
2014).
Variaciones similares en la acumulación de la OTC fueron reportadas por Gómez-Jiménez et al. (2008) en
un estudio realizado con camarón P. vannamei alimentado con una
dieta con OTC a 5,000 mgKg-1, y mantenido bajo condiciones de
laboratorio, encontrándose acumulaciones de OTC en el hepatopáncreas de 194.37 ±
16.11 µgg-1 y en músculo de 33.54 ± 11.19 µgg-1, valores
similares a los que se detectaron en los tejidos de los organismos que recibieron la
dieta de OTC-1. Cuartas et al.
(2002) señalaron que aun cuando las concentraciones de OTC en
hepatopáncreas son altas, su eliminación se acelera debido a la función que este
órgano tiene en el metabolismo del camarón, que es la asimilación del alimento
mediante un proceso integrado en el que participan enzimas digestivas, digestión y
absorción de nutrientes, almacenamiento y disposición de productos de desecho.
Existen estudios que han evaluado la acumulación de OTC en músculo y hepatopáncreas
de camarón (Gómez-Jiménez et al.,
2008; Bermúdez-Almada et
al., 2014), estos autores señalan que la acumulación de la
OTC en los tejidos depende de diversos factores. Dentro de estos están los abióticos
(temperatura, salinidad y oxígeno disuelto, entre otros) y los biológicos, donde
interviene el metabolismo que se considera muy importante en la acumulación del
antibiótico, ya que durante los períodos de muda, los camarones dejan de
alimentarse, influyendo directamente en la acumulación y por ende en la Cmáx alcanzada en los distintos tejidos. También la Cmáx alcanzada dependerá de la pureza de la molécula del antibiótico, el proceso
de adición del antibiótico al alimento y la efectividad del mecanismo de acción del
antibiótico (Ma et al.,
2019).
Es importante determinar la Cmáx alcanzada de la OTC en los tejidos
de los organismos, dado que estos valores se comparan con las Concentraciones
Mínimas Inhibitorias (CMI) detectadas en las bacterias aisladas de esos mismos
tejidos, y se puede conocer si la concentración del antibiótico acumulada en los
tejidos es suficiente para inhibir el crecimiento bacteriano. Las bacterias aisladas
del camarón Penaeus vannamei en esta investigación presentaron
valores de CMI de 0.5 µgmL-1 para OTC en especies de
Vibrio (Datos en prensa, Latin American Journal of Aquatic
Research), lo que demuestra la susceptibilidad a la OTC de las poblaciones
bacterianas aisladas de los organismos estudiados. Mientras que en un estudio
realizado por Santiago-Hernández (2009) se
reportaron acumulaciones de OTC en músculo de 27.9 ± 1.67 µgg-1 y en
hepatopáncreas de camarón de 212.5 ± 0.4 µgg-1, que fueron consideradas
adecuadas cuando se relacionaron con las CMI de la OTC, y oscilaron entre 0.75 a 100
µgmL-1 en bacterias Vibrio sp aisladas de un sistema
de cultivo de camarón. Mientras que Roque,
Molina-Aja, Bolan-Mejia & Gómez-Gil (2001) evaluaron la sensibilidad
a 15 antibióticos mostrada por 144 cepas de Vibrio sp aisladas
también de un sistema de cultivo de camarón, cuyos resultados mostraron que el mayor
número de cepas fueron resistentes a la OTC y la concentración requerida de este
antibiótico para lograr su inhibición fue de 304 µgmL-1, valor superior a
las concentraciones máximas que generalmente se acumulan en los tejidos.
Otro aspecto importante de resaltar es la relevancia que tiene el establecimiento del
período de retiro de la OTC en los tejidos antes de su cosecha, con el propósito de
evitar la presencia de residuos de antibióticos que rebasen los límites máximos
establecidos en otros países como la FDA (0.2 µgg-1) y la Unión Europea
(0.1 µgg-1), que pueda repercutir en un rechazo del producto con las
consecuentes implicaciones comerciales, así como un riesgo a la salud de la
población en general por el desarrollo de resistencia bacteriana.
Conclusiones
Los parámetros fisicoquímicos mantenidos durante el bioensayo favorecieron una alta
sobrevivencia de los camarones P. vannamei, y la evaluación de los
parámetros biológicos arrojó resultados favorables para los organismos tratados con
los alimentos OTC-1 y OTC-2 con distintas concentraciones del antibiótico.
El proceso industrial para la elaboración del alimento OTC-1 mostró ser ineficiente
debido a que se detectó que el alimento no contenía la concentración indicada de
oxitetraciclina, por lo que es necesario un mayor control de calidad en el proceso
de elaboración del alimento medicado, que incluya análisis de rutina empleando
técnicas analíticas confiables para asegurar la concentración del antibiótico en el
producto terminado que será utilizado en el tratamiento de enfermedades bacterianas
en camarón de cultivo.
El procedimiento que se utilizó para la preparación del alimento OTC-2 en la granja
no fue adecuado para obtener la concentración requerida de OTC. Por lo que se
sugiere que no se realicen este tipo de prácticas en las granjas camaronícolas, ya
que si se aplican dosis subterapéuticas a los organismos en cultivo, esto podría
representar un impacto de contaminación con antibióticos al entorno de la
producción, lo que favorece el desarrollo de resistencia bacteriana de agentes
patógenos, representando un riesgo a la salud humana, además de afectar la
producción del camarón.
Con base en los resultados obtenidos en este estudio, se identifica la importancia de
continuar realizando investigaciones en este campo, con el propósito de recomendar
la implementación de sistemas de calidad en las plantas de fabricación de alimentos
destinados a la producción acuícola, así como evitar prácticas inadecuadas de
medicación de alimento en las granjas de cultivo de camarón, esto con el propósito
de que los alimentos adicionados con antibiótico contengan la concentración adecuada
que pueda asegurar terapias efectivas en el control de enfermedades bacterianas en
los cultivos acuícolas, minimizando el impacto al medio ambiente y el riesgo a la
salud humana por el desarrollo de resistencia bacteriana.
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