La técnica del encapsulado de las células microbianas ha sido ampliamente utilizada en la agricultura, la industria farmacéutica y alimentaria (entre otras), como una estructura o cápsula que permite la protección, liberación y funcionamiento del ingrediente activo (Schoebitz, López & Roldán, 2013). Para el encapsulado o inmovilización celular, se ha propuesto el uso de polímeros biodegradables que en las últimas décadas han recibido mucha más atención debido a su potencial aplicación en los campos relacionados a la protección ambiental y el mantenimiento de la salud física (Vroman & Tighzert, 2009). De los biopolímeros existentes, el ácido algínico o alginato, es producido por algas marinas, principalmente las feofitas (pardas) como Macrocystis pyrifera, Laminaria digitata, Laminaria hyperborean y Eklodia cava; aunque no es exclusivo de estas algas, algunas bacterias como Azotobacter vinelandii y cepas de Pseudomonas, son capaces de producir alginato.

El alginato es el biopolímero más comúnmente utilizado para la bioencapsulación de diferentes microorganismos como, Azospirillum brasilense (Bashan, 1986; Yabur et al., 2007; Bashan, Salazar & Puente, 2009; Trejo et al., 2012); Pseudomonas fluorescense (van Elsas et al., 1992; Bashan & González, 1999; Russo, Basaglia, Tola & Casella, 2001); Bacillus subtilis (Young, Rekha, Lai & Arun, 2006; Rekha, Lai, Arun & Young, 2007; Trivedi & Pandey, 2008); Chlorella sorokiniana (Yabur, Bashan & Hernández-Carmona, 2007; Trejo et al., 2012), entre otros. Sin embargo, la bioencapsulación de las cianobacterias es un campo poco estudiado.

Las cianobacterias son un excelente sistema utilizado como modelo metabólico dinámico que puede proporcionar a los biotecnólogos nuevos genes y biomoléculas para diversos usos en la agricultura, la industria y la sustentabilidad ambiental (Prasanna, Jaiswal & Kaushik, 2008). El uso de cianobacterias como biofertilizante en los cultivos se conoce desde el siglo pasado, principalmente en el arroz con ventajas como: promover la actividad microbiológica, mejorar las propiedades físicas y químicas del suelo, así como participar en el reciclaje de nutrientes y beneficiar la productividad de los cultivos (Miransari, 2010; Singh, Pandey & Singh, 2011); también por su capacidad de fijación de nitrógeno (ej. Fischerella, Nostoc, Anabaena) contribuyen aportándolo al cultivo y de esta manera promover la disminución del uso de fertilizantes químicos en cultivos como el maíz (Trujillo-Tapia & Ramírez-Fuentes, 2016). El bioencapsulado de cianobacterias con alginato de calcio, es una alternativa viable para mejorar las condiciones de aplicación, rendimiento y eficiencia del biofertilizante; protege al microorganismo de los factores de estrés biótico y abiótico (contaminantes, organismos antagónicos, temperatura, sequedad, luz UV y estrés mecánico), creando un microambiente que conduce a un tiempo de vida útil más largo y al mantenimiento de la actividad metabólica por largos periodos de tiempo, no sólo durante el almacenamiento sino también después de la aplicación (Vemmer & Patel, 2013). Además, se ha demostrado que las células fotosintéticas inmovilizadas presentan mayor eficiencia y estabilidad (Cortez, Nicolau Flickinger & Mota, 2017).

La investigación realizada en el campo de la inmovilización de microorganismos, reporta diversas técnicas para el bioencapsulado y su uso como inoculantes para el desarrollo de las plantas (Schoebitz et al., 2013), o bien, en el desarrollo de métodos para obtener mejores resultados como agentes de control biológico (Vemmer & Patel, 2013) e inclusive en la remoción de contaminantes de agua residual (de-Bashan & Bashan, 2010); sin embargo, observamos un vacío de conocimiento con respecto a la concentración del microorganismo que se utilizará como inóculo para la elaboración de los bioencapsulados.

Por lo anterior, en el presente trabajo tuvimos como objetivos: 1) demostrar que el bioencapsulado de Fischerella sp., en perlas de alginato de calcio es una alternativa viable para su crecimiento; y 2) obtener la mejor concentración de un inóculo probada para el crecimiento de Fischerella sp.

Aislamiento, identificación y crecimiento de Fischerella sp.

La cepa de Fischerella sp., se obtuvo a partir de un consorcio de cianobacterias aisladas en el suelo agrícola de la zona de Bajos del Arenal, Oaxaca. La muestra de 10 g de suelo se inoculó en un matraz de 250 mL que contenía 200 mL de medio de cultivo BG11° (Rippka, Deruelles, Waterbury, Herdman & Stanier, 1979) (Cuadro I) para aislar las cianobacterias fijadoras de nitrógeno (CFN). Después de 14 días a partir de la inoculación, Fischerella sp. se aisló mediante diluciones seriadas (Andersen & Kawachi, 2005) y se identificó morfológicamente (Holt, Krieg, Sneath, Stanley & Williams, 1994). Posteriormente se cultivó en el mismo medio (BG11°) con un fotoperiodo 12:12 luz-oscuridad (75.60 µmol m^-2 s^-1), temperatura de 25 °C ± 2 y aireación constante de 2 L min^-1 (bomba de aire de 25 w) durante 30 días para obtener suficiente biomasa para el proceso de bioencapsulado.

Cuadro I

Reactivo	BG11°	BG11
	(g L-1)
NaCl	0.23	0.23
MgSO4 · 7H2O	0.075	0.075
CaCl2 · 2H2O	0.036	0.036
C6H8O7 (ácido cítrico)	0.006	0.006
C10H14N2Na2O8 (EDTA)	0.001	0.001
K2HPO4 · 3H2O	0.04	0.04
C6H5FeO7 (Citrato férrico)	0.006	0.006
NaNO3	-	0.015
Na2CO3	0.02	0.02
*Solución de oligoelementos	1 (mL L-1)	1 (mL L-1)
H3BO3	0.286	0.286
MnCl2 · 4H2O	0.181	0.181
ZnSO4 · 7H2O	0.022	0.022
Na2MoO4 · 2H2O	0.039	0.039
CuSO4 · 5H2O	0.0079	0.0079
CoCl2	0.00494	0.00494
Co(NO3)2 · 6H2O	-	0.05

Bioencapsulado de Fischerella sp.

La técnica basada en Bashan (1986) fue utilizada para el encapsulado de la cianobacteria. Un mililitro de biomasa de Fischerella sp. (0.07 de densidad óptica, 675 nm) se mezcló homogéneamente en 100 mL de una solución al 2% de alginato de calcio (obtenido de M. pyrifera, CICIMAR-IPN, México); la mezcla (alginato-cianobacterias) se colocó en una bureta graduada de 25 mL y lentamente se adicionó a una solución de cloruro de calcio (CaCl₂) al 10% para formar el bioencapsulado (perlas); una vez formadas se dejaron en la solución de CaCl₂ durante 1 minuto, posteriormente se retiraron y lavaron en repetidas ocasiones con agua destilada estéril, para remover el exceso del CaCl₂. Con los 100 mL de la solución al 2% de alginato de calcio se produjeron aproximadamente 400 bioencapsulados.

Crecimiento y metabolismo de Fischerella sp. bioencapsulada vs células libres

Se establecieron dos tipos de cultivo en lote para el crecimiento de Fischerella sp.: i) cultivo en lote de células libres, y ii) cultivo en lote de células bioencapsuladas en alginato de calcio; además se utilizaron dos medios de cultivo, el medio mineral (BG11) (Rippka et al., 1979) y un medio mineral sin nitrógeno (BG11°) (Cuadro I).

El cultivo de células libres se realizó mezclando 5 mL (0.07 de densidad óptica, 675 U.A.) del inóculo de Fischerrella sp. en 500 mL de medio mineral (BG11 y BG11°), empleando un matraz de 1 L marca Duran. Para el cultivo con los bioencapsulados de Fischerrella sp. se colocaron aproximadamente 400 perlas (previamente elaboradas) en un matraz de 1 L marca Duran conteniendo el medio mineral (BG11 y BG11°).

El cultivo de células libres y bioencapsuladas se mantuvieron en condiciones controladas durante la cinética, con un ciclo de 12:12 luz:oscuridad (75.60 µmol m^-2 s^-1), aireación de 2 L min^-1 (bomba de aire de 25 w) y una temperatura constante de 25 ± 2 ºC; el pH del cultivo fue de 7.0.

El crecimiento de Fischerella sp., se determinó por peso seco (PS). Durante la cinética se tomó semanalmente una alícuota de 5 mL del cultivo de células libres y se filtraron con una bomba para vacío. Por otra parte, 50 perlas de cada tratamiento se disolvieron en 5 mL de una solución de bicarbonato de sodio al 4% durante 24 horas. En ambos cultivos se procedió de acuerdo con el método de Arredondo-Vega, Cordero-Esquivel & Voltolina (2017).

El metabolismo celular en ambos cultivos (células libres y bioencapsuladas) se evaluó con la cuantificación extracelular de amonio (NH₄ ⁺), clorofila “a” (Cl “a”), carotenos totales (CT), carbohidratos intracelulares totales (CHT) y de ficobiliproteínas: ficocianinas (FC), aloficocianinas (AFC) y ficoeritrinas (FE). Se tomó semanalmente (durante la cinética) una alícuota de 5 mL del cultivo de células libres previamente filtradas (40 mm de diámetro y poro de 5-8 µm) y se procedió al análisis de acuerdo al método para cada metabolito. Por otra parte, 50 perlas de cada tratamiento se disolvieron en 5 mL de una solución de bicarbonato de sodio al 4% durante 24 horas, posteriormente se centrifugaron a 6,000 rpm por 5 minutos a 25 °C, se desechó el sobrenadante y la pastilla se volvió a suspender en agua destilada, se agitó vigorosamente y se centrifugó nuevamente a las mismas condiciones durante 10 minutos. La cuantificación de NH₄ ⁺, Cl “a”, CT y CH se estimó por el análisis espectrofotométrico (Beckman DU-530). El NH₄ ⁺ a 630 U. A., de acuerdo con el método del fenato (APHA-AWA-WPCF 1992); Cl “a” y CT a 470 y 750 U. A. (respectivamente), por el método de Sukenik, Carmeli & Berner (1989); los CH a 485 U. A. (Duboís, Gilles, Hamilton, Rebers & Smith, 1956). La extracción y cuantificación de las ficobiliproteínas (FC, AFC y FE) se realizó por congelación y descongelación reiterada (Siegelman & Kycia, 1978). La concentración de ficobiliproteínas se calculó utilizando las ecuaciones basadas en los coeficientes de extinción específicos para pigmentos en cianobacterias:

F C   m g   m L - 1 = [ A 615   -   0.474   A 652 ]   /   5.34

A F C   m g   m L - 1 = [ A 652   -   0.208   A 615 ]   /   5.09

F E   m g   m L - 1 = [ A 562   -   2.41   F C -   0.849   A F C ]   /   9.62

A₆₅₂, A₆₁₅ y A₅₆₂ representan la absorbancia medida a 652, 615 y 562 U.A. (Siegelman & Kycia, 1978).

Concentración del inóculo de Fischerella sp. para los bioencapsulados

Se diseñó un experimento para evaluar el crecimiento celular y la actividad metabólica de Fischerella sp., probando diferentes concentraciones del inóculo al momento de elaborar los bioencapsulados; se tomaron 1, 5, 10 y 20 mL del cultivo de cianobacterias para obtener inóculos de 1, 5, 10 y 20%, respectivamente y el control (perlas sin cianobacterias). En cada matraz de 500 mL conteniendo 250 mL del medio de cultivo BG11° se colocaron los bioencapsulados y se mantuvieron en las mismas condiciones: un ciclo de 12:12 luz:oscuridad (75.60 µmol m^-2 s^-1), aireación de 2 L min^-1 y una temperatura de 25 ± 2 °C, durante 35 días. Cada tratamiento se hizo por duplicado. La determinación del crecimiento y metabolismo de Fischerella sp. fue como se mencionó anteriormente.

Análisis estadístico

Los resultados fueron sometidos a un análisis de varianza de una vía (ANDEVA) y la comparación entre medias utilizando la prueba de diferencia mínima significativa (DMS) calculada a ρ < 0.05. El procedimiento estadístico se llevó a cabo con el software Statistica 7.0.

Crecimiento y metabolismo de Fischerella sp.: Bioencapsulada vs células libres

El crecimiento y metabolismo de Fischerella sp. fue superior en el bioencapsulado en comparación con las células libres. Los valores de PS (Figura 1) y NH₄ ⁺ de Fischerella sp. se incrementaron en 2.8 veces más en el bioencapsulado vs las células libres; y fueron significativamente diferentes (ρ < 0.05). La concentración de NH₄ ⁺ en el bioencapsulado se incrementó con el tiempo (semana 1 a la 8); pasó de 6.78 µg mL^-1 a 23.45 µg mL^-1, el incremento fue de 3.4 veces; la concentración de NH₄ ⁺ en las células libres pasó de 5.28 a 6.06 µg mL^-1 con un incremento de 1.1 veces (Figura 2).

Figura 1

Figura 2

La concentración de CHT en el bioencapsulado fue 2.2 veces mayor en comparación con las células libres (Cuadro II) y significativamente diferente (F_{[1, 64]}= 220.08, ρ = 0.000). Con relación al análisis de FC, AFC y FE; en los tres parámetros, los valores obtenidos fueron mayores en el bioencapsulado vs células libres (Cuadro II), sin presentar diferencias significativas (ρ < 0.05).

Cuadro II

Indicador	Bioencapsulados	Células libres
Peso seco (g L-1)	1.726 a ± 0.049	0.601b ± 0.141
Amonio (µg mL-1)	15.42 a ± 0.988	5.28 b ± 0.279
CHT (µg mL-1)	69.2 a ± 1.136	30.54 b ± 2.547
Carotenos Totales (µg mL-1)	0.039 b ± 0.005	0.124 a ± 0.021
Cl “a” (µg mL-1)	0.115 b ± 0.026	0.520 a ± 0.100
Ficocianinas (µg mL-1)	0.013 a ± 0.001	0.010 a ± 0.001
Aloficocianinas (µg mL-1)	0.002 a ± 0.000	0.001 a ± 0.000
Ficoeritrinas (µg mL-1)	0.020 a ± 0.001	0.016 a ± 0.001

CHT: carbohidratos extracelulares totales.

De los parámetros analizados, únicamente la concentración de CT y Cl “a” en las células libres fue mayor comparado con el bioencapsulado. El valor de CT y Cl “a” en células libres fue de 3.1 y 4.5 veces más (respectivamente) que en el bioencapsulado; en ambos casos existió diferencia significativa (ρ < 0.05) (Cuadro II). La concentración de Cl “a” en el bioencapsulado pasó de 0.0405 µg mL^-1 (semana 1) a 0.3879 µg mL^-1 (semana 8); por su parte, la concentración de Cl “a” en las células libres fue de 0.111 µg mL^-1 (semana 1) y se incrementó hasta llegar a 1.172 µg mL^-1 (semana 8). La concentración de CT en el bioencapsulado pasó de 0.010 µg mL^-1 (semana 1) a 0.094 µg mL^-1 (semana 8); en las células libres la concentración fue de 0.030 µg mL^-1 (semana 1) y se incrementó semanalmente hasta llegar a 0.225 µg mL^-1 (semana 8).

Con respecto a la cinética de Fischerella sp. bioencapsuladas y en células libres en el medio de cultivo sin nitrógeno (BG11°) y con nitrógeno (BG11), los resultados obtenidos muestran que el PS, la concentración de NH₄ ⁺ y CHT, fueron mayores en el medio BG11 vs BG11°. El valor de PS, NH₄ ⁺ y CHT en el medio BG11 fue de 2.08 g L^-1, 19.42 y 85.66 µg mL^-1 (respectivamente) y en el medio BG11° mayor que 1.76 g L^-1, 14.87 y 75.53 µg mL^-1 (respectivamente) (Cuadro II). En los tres parámetros analizados existió diferencia significativa (ρ < 0.5). Por el contrario, los valores de CT y Cl “a” fueron mayores en el medio BG11° vs BG11, en bioencapsulados y células libres. El valor de CT y Cl “a” en el medio BG11° fue de 0.187 y 0.712 µg mL^-1 (respectivamente); y en el medio BG11 mayor a 0.137 y 0.555 µg mL^-1 (respectivamente). En los dos parámetros analizados existió diferencia significativa (ρ < 0.05) (Cuadro III). La concentración de FC, AFC y FE no mostraron diferencias significativas entre el bioencapsulado y células libres, ni entre el medio BG11° y BG11.

Cuadro III

Indicador	BG11°	BG11
Peso seco (g L-1)	1.761 b ± 0.129	2.086 a ± 0.129
Amonio (µg mL-1)	14.87 b ± 0.988	19.14 a ± 0.279
CHT (µg mL-1)	75.53 b ± 2.417	85.66 a ± 2.417
Carotenos Totales (µg mL-1)	0.187 a ± 0.020	0.137 b ± 0.020
Cl “a” (µg mL-1)	0.712 a ± 0.097	0.555 b ± 0.097
Ficocianinas (µg mL-1)	0.023 a ± 0.001	0.021 a ± 0.001
Aloficocianinas (µg mL-1)	0.004 a ± 0.000	0.003 a ± 0.000
Ficoeritrinas (µg mL-1)	0.025 a ± 0.001	0.026 a ± 0.001

CHT: carbohidratos extracelulares totales.

Concentración del inóculo: 1, 5, 10 y 20%, en células bioencapsuladas

El crecimiento de Fischerella sp. se determinó a través del PS de la biomasa; en la concentración al 20% del inóculo el valor de PS fue de 0.032 µg mL^-1, y estadísticamente con diferencias significativas (F[_{3, 30}] = 11.061, ρ = 0.000) respecto al inóculo de 10, 5 y 1% (Cuadro IV).

Cuadro IV

Indicador	Inóculo de Fischerella sp.
	Control	1%	5%	10%	20%
Peso seco (g L-1)	0.79 ± 0.0	0.0252 c ± 0.0	0.0293 b ± 0.0	0.030 ab ± 0.0	0.032 a ± 0.001
Amonio (µg mL-1)	8.12 ± 0.0	29.0 a ± 2.5	33.2 a ± 2.1	29.6 a ± 4.0	28.9 a ± 4.0
Carotenos Totales (µg mL-1)	0.0 ± 0.0	0.34 b ± 0.02	0.40 ab ± 0.04	0.48 ab ± 0.03	0.53 b ± 0.06
CET (µg mL-1)	0.003 ± 0.0	48.82 b ± 7.18	70.76 a ± 3.75	76.37 a ± 5.20	71.98 a ± 5.85
Cl “a” (µg mL-1)	0.000 ± 0.0	1.23 b ± 0.13	1.49 ab ± 0.20	1.75 ab ± 0.16	1.97 a ± 0.27
Ficocianinas (µg mL-1)	0.004 ± 0.0	0.010 b ± 0.0	0.014 ab ± 0.002	0.009 b ± 0.002	0.018 a ± 0.001
Aloficocianinas (µg mL-1)	0.000 ± 0.0	0.004 b ± 0.0	0.005 b ± 0.001	0.004 b ± 0.0	0.008 a ± 0.0
Ficoeritrinas (µg mL-1)	0.004 ± 0.0	0.002 a ± 0.0	0.002 a ± 0.000	0.002 a ± 0.0	0.002 a ± 0.0

CET: carbohidratos extracelulares totales.

La concentración promedio total de NH₄ ⁺ para cada inóculo (1, 5, 10 y 20%) no fue significativamente diferente (F[_{3, 30}] = .420, ρ = .739) (Cuadro IV). Sin embargo, durante la cinética, se obtuvo una mayor concentración de NH₄ ⁺ en la semana dos (73.51 µg mL^-1), y fue de 5.5, 5.6, 2.6 y 3.1 veces más que en la semana 1, 3, 4 y 5 respectivamente. La diferencia fue significativa estadísticamente (F[_{4, 10}] = 34.780, ρ =0.00001).

La concentración promedio final de CET de Fischerella sp. con el inóculo al 1% fue de 48.82 µg mL^-1 (Cuadro IV), y de 1.4, 1.5 y 1.4 veces menos que la concentración del inóculo al 5, 10 y 20%, respectivamente. El inóculo al 1% presentó el valor más bajo en cada una de las semanas del estudio; siendo estadísticamente diferente (F[_{3, 30}] = 4.226, ρ = 0.013). En la cinética de 5 semanas, la concentración de CET fue mayor en la semana 2 (µg mL^-1) con respecto a la semana 1, 3, 4 y 5, sin llegar a presentar diferencias significativas (F[_{12, 30}] = 0.512, ρ = 0.971).

La concentración promedio total de CT de Fischerella sp. fue de 0.34, 0.40, 0.48 y 0.53 µg mL^-1 y en la del inóculo de 20, 10, 5 y 1% respectivamente (Cuadro IV), es decir, a mayor concentración del inóculo mayor concentración de CT; las diferencias son estadísticamente significativas (F[_{3, 30}] = 3.054, ρ = 0.043).

La concentración promedio total de Cl “a” de Fischerella sp. sin diferencia estadística con la del inóculo cuyo valor promedio más bajo se dio al 1% (Cuadro IV). En la semana 5, la concentración de Cl “a” (5.33 µg mL^-1) se incrementó en 10.4, 8.3, 10.4 y 4.9 veces comparado a la semana 1, 2, 3 y 4, respectivamente (Figura 3).

Figura 3

La concentración promedio total de AFC de Fischerella sp. fue mayor en el porcentaje del inóculo al 20%, y significativamente diferente (F[_{3, 30}] = 4.427, ρ = 0.029) al 1, 5 y 10% (Cuadro IV). La concentración de AFC de la semana 1 a la 4, tuvo un valor promedio por semana de 0.003 µg mL^-1, cinco veces menor con respecto a la semana 5 (0.015 µg mL^-1) y significativamente distinta (F[_{12, 30}] = 2.159, ρ = 0.043). La concentración de FC producidas por el inóculo al 20% se presentó mayor con diferencia estadística a las FC producidas por el inóculo al 1, 10 y 5% (F[_{3, 30}] = 3.939, ρ = 0.017) (Cuadro IV). Durante la cinética de crecimiento de Fischerella sp., la concentración de FC fue en incremento cada semana: 1 y 2 (0.001 µg mL^-1), 3 (0.004 µg mL^-1), 4 (0.014 µg mL^-1) y 5 (0.045 µg mL^-1), sin diferencia significativa (F[_{12, 30}] = 2.060, ρ = 0.0.535). Finalmente, la concentración promedio total de FE tuvo un comportamiento similar a las FC, esto es, un incremento de la semana 1 a la 5, sin ser significativo. De igual modo, la concentración del inóculo en las FE, no tuvo diferencias significativas (F[_{3, 30}] = 0.356, ρ = 0.784) (Cuadro IV).

En el presente estudio se evaluó el crecimiento y metabolismo de las células procariotas fotosintéticas libres y bioencapsuladas en alginato de calcio, con diferentes porcentajes de inóculo (1, 5, 10 y 20%).

El bioencapsulado en alginato de calcio demostró ser una buena alternativa para el mejor crecimiento y producción de amonio en Fischerella sp. El crecimiento de las células libres de Fischerella fue menor (0.601 g L^-1) en comparación con las células bioencapsuladas (1.726 g L^-1). Rai & Mallick (1992) reportaron resultados similares en el crecimiento de Anabaena y Chlorella encapsuladas en alginato vs células libres. A diferencia de las células libres, el bioencapsulado protege a las células del estrés biótico y abiótico, manteniendo la actividad metabólica y viabilidad por periodos de tiempo más largos. La pared celular de las cianobacterias está formada por 3 o 4 capas compuestas de lipopolisacáridos y péptido glicano, ácido murámico + glucosamina (Gumbo, Ross & Cloete, 2008); por su parte el alginato es un polisacárido lineal (extraído de algas cafés), constituido de dos monómeros: ácido β-D-manurónico y ácido α-L-gulurónico. La similitud en la composición de ambas estructuras (pared celular y alginato) podría ayudar a la cianobacteria a protegerse contra el efecto del estrés hidrodinámico (agitación, aireación) y evitar daños letales y subletales (Trujillo-Roldán & Valdez-Cruz, 2006). La aireación generalmente se requiere en los cultivos de cianobacterias para el intercambio de gases, proporcionar CO₂ como fuente de carbono y remover el O₂ producido en la fotosíntesis (Ugwu, Aoyagi & Uchiyama, 2008). Converti, Lodi, Del Borghi & Solisio (2006) determinaron que un flujo de aireación mayor a 2.0 L min^-1 podría dañar a las células de las cianobacterias; sin embargo, esto va a depender de múltiples factores como son: tamaño celular, morfología, composición de la pared celular y la tolerancia al estrés hidrodinámico (Wang & Lan, 2018).

El grupo de cianobacterias diazotróficas como Fischerella sp. fijan el nitrógeno atmosférico (N₂), lo transforman a amoniaco (NH₃) y posteriormente es hidratado para formar amonio (NH₄ ⁺) (Noreña-Caro & Benton, 2018); la fijación del nitrógeno se lleva a cabo por la actividad de la nitrogenasa. En nuestro estudio, las células bioencapsuladas presentaron una mayor producción de NH₄ ⁺ en comparación con las células libres (Figura 2) y esto mismo en, la producción de NH₄ ⁺ en células encapsuladas de Mastigocladus laminosus y Chlamydomonas reinhardtii (Brouers & Hall, 1986; Santos-Rosa, Galván & Vega, 1989). Al respecto, Syiem (2005) reportó una mayor frecuencia de heterocistos y mayor actividad de la nitrogenasa en células inmovilizadas (encapsuladas) de Nostoc en comparación a las células libres; como una posible explicación a la mayor producción de amonio, previa fijación del N₂. La asimilación primaria de amonio derivado de la fijación del N₂ se realiza mediante la enzima glutamino sintasa; sin embargo, los niveles más altos de NH₄ ⁺ externo se vuelven perjudiciales porque la mayor parte del amonio se convierte en amoniaco libre (NH₃), y a medida que aumenta su concentración, el pH puede superar el valor de 9.2 (Noreña-Caro & Benton, 2018). Ante esta situación, la inmovilización de las células de Fischerella sp. (y en general de las células microbianas), funciona como una manera de preservar la viabilidad celular ante condiciones perjudiciales del ambiente como: cambios en el pH, daño por productos del metabolismo, estrés osmótico, cambios en la temperatura, así como mejorar la estabilidad durante el almacenamiento (Rathore, Desai, Liew, Chan & Heng, 2013).

Por otra parte, en la cinética de Fischerella sp. el crecimiento (PS) fue mayor en BG11 vs BG11°. Sin embargo, la producción de Cl “a” en medio BG11° fue mayor en comparación con el medio BG11, en bioencapsuladas y células libres. La Cl “a” es el pigmento más importante en los organismos fotosintéticos. El mayor contenido de clorofila está relacionado con el creciente requerimiento de energía (luz) para una mayor producción de compuestos bioquímicos como las proteínas. La capacidad de la cianobacteria de fijar nitrógeno promueve el incremento de heterocistos cuando el medio carece de nitrógeno en células de A. siamensis (Taikhao & Phunpruch, 2017), mejorando la actividad de la nitrogenasa. El incremento en el número de células y contenido de Cl “a” indica que las células de Fischerella sp. posterior a la inmovilización podían tener división celular y realizar la fotosíntesis; según lo reportó Tam & Wong (2000) para las células de Chlorella vulgaris, y Ruíz-Marín, Mendoza-Espinosa & Stephenson (2010) para las de Scenedesmus obliquus y Ch. vulgaris, inmovilizadas (encapsuladas) en alginato de calcio, en ambos trabajos.

El bioencapsulado de células microbianas presenta ventajas en comparación a las de las células libres (Vemmer & Patel, 2013) para emplearse con diversos propósitos (Cortez et al., 2017); sin embargo, no se ha reportado si la concentración del inóculo del bioencapsulado, tiene un efecto en el crecimiento y/o metabolismo de las células, o en la eficiencia del propósito del bioencapsulado: degradación de contaminantes, fotosíntesis, producción de H₂, NH₄+, y biodiesel, entre otros.

De los cuatro porcentajes del inóculo utilizados, la concentración del 20% fue mejor para el crecimiento del (PS) de Fischerella sp.; sin embargo, y de acuerdo con los resultados (Cuadro III), el PS está directamente relacionado a la cantidad del inóculo inicial. La concentración promedio total de NH₄ ⁺ para cada inóculo del (1, 5, 10 y 20%) no fue significativamente diferente; pero en la semana dos, la producción de NH₄ ⁺ fue mayor y precisamente en esta semana se presenta la fase exponencial de la curva de crecimiento de Fischerella sp., por lo tanto, si el propósito (uso) de la inmovilización de Fischerella sp. es utilizarla como biofertilizante, en la semana dos sería el momento indicado para cosechar y obtener el producto.

Los principales pigmentos fotosintéticos en las cianobacterias son las clorofilas y las ficobilinas; mientras la clorofila está muy extendida entre los organismos fotosintéticos, las ficobilinas son exclusivas de las cianobacterias, algas rojas y criptofitas (Noreña-Caro & Benton, 2018). La concentración de FC, AFC y FE no mostraron diferencias significativas entre el bioencapsulado y las células libres, ni entre el medio BG11° y BG11; debido a su papel en la captación de luz y a que la estructura de las ficobiliproteínas es muy estable (Pagels, Guedes, Amaro, Kijjoa & Vasconcelos, 2019), por lo tanto, las condiciones de luz, temperatura, fuente de N y pH del experimento, no tuvieron un efecto negativo en la producción de las ficobiliproteínas (FC, AFC y FE). Sin embargo, Fischerella sp. en condiciones de intensidad media (75.60 µmol m^-2 s^-1) en la concentración del inóculo al 20%, fue significativamente mayor en la producción de ficocianinas y aloficocianinas -comparado con el inóculo del 1, 5 y 10%- y coincide con la mayor biomasa (peso seco) y concentración de clorofila (Cuadro III). Kovac, Babic, Milovanovic, Misan & Simeunovic (2017), reportaron resultados similares en varias especies de cianobacterias (Anabaena, Nostoc y Spirulina) en iluminación continua y diferentes fuentes de carbono.

Con base en los resultados obtenidos, la bioencapsulación con alginato de calcio, demostró ser una alternativa viable para el crecimiento y metabolismo de la cianobacteria Fischerella sp. Lo anterior se comprobó con la mayor producción de NH₄ ⁺ en el bioencapsulado en comparación con las células libres.

Con relación al inóculo, la concentración del 20% promovió el mejor crecimiento de Fischerella sp.

Finalmente, podemos mencionar que el sistema propuesto de bioencapsulados con Fischerella sp., representa una alternativa biotecnológica para la producción de biofertilizantes y así contribuir con el medio ambiente al promover la disminución de los fertilizantes químicos.