Una de las enfermedades de mayor importancia en el sector agrícola es la pudrición carbonosa causada por el hongo fitopatógeno Macrophomina phaseolina (Tassi) Goid, el cual es un hongo necrotrófico, polífago y ampliamente distribuido a nivel mundial. Este hongo que es transmitido a través del suelo y semillas, subsiste en forma de microesclerocios y tiene la posibilidad de afectar a más de 500 especies de plantas, incluyendo distintas especies de granos de importancia económica como las leguminosas (Premamalini et al., 2012; Ramos et al., 2016). En los últimos años, se ha incrementado el uso indiscriminado de sustancias químicas para el control de este y otros fitopatógenos, con el consecuente impacto negativo al ambiente y a la salud de los seres humanos (Smalling et al., 2013; Peña et al., 2018). Esta problemática ha impulsado la búsqueda de nuevas estrategias que permitan reemplazar o minimizar el uso de sustancias químicas nocivas en la agricultura, una de ellas es el control biológico de fitopatógenos.

Una alternativa para el control biológico de M. phaseolina, es el uso de especies del género Trichoderma, el cual agrupa hongos cosmopolitas con gran capacidad reproductiva, alta competitividad y amplia diversidad metabólica (Lopes et al., 2012). Este grupo de hongos suele aislarse generalmente del suelo, pero también se pueden encontrar en madera húmeda en descomposición y asociados a las raíces (Chaverri y Samuels, 2003; Kubicek et al., 2008), y han sido ampliamente estudiados con el fin de controlar fitopatógenos nativos del suelo (Guigón-López et al., 2010). Son capaces de competir por el espacio, los nutrientes e inhibir el crecimiento de los patógenos usando metabolitos secundarios que actúan como fungicidas (Reino et al., 2008; Vinale et al., 2014) o degradando la pared celular por acción de enzimas hidrolíticas como quitinasas y celulasas (Infante et al., 2009; Qualhato et al., 2013; Saravanakumar et al., 2017).

Elucidar la naturaleza de los agentes responsables de la antibiosis de Trichoderma, es fundamental para la comprensión de la actividad biológica observada, y podría proporcionar nuevas estrategias de control de M. phaseolina más amigables con el ambiente. El objetivo del presente trabajo fue determinar la capacidad de antibiosis de Trichoderma arundinaceum, T. brevicompactum y T. harzianum, contra dos aislamientos de M. phaseolina.

Todos los experimentos se llevaron a cabo en la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Nacional de Asunción, Paraguay, en el periodo comprendido entre octubre de 2015 y marzo del 2016.

Obtención, preservación y cultivo de microorganismos

Se utilizaron tres cepas de referencia de Trichoderma: T. arundinaceum (IBT40837), T. brevicompactum (IBT40841) y T. harzianum T34 (CECT2413); todas ellas donadas por el Departamento de Química Orgánica de la Universidad de Cádiz, y que fueron conservadas en glicerol al 80% a -20 °C. De M. phaseolina, se utilizaron dos aislamientos oriundos de Paraguay: M. phaseolina FCQ6, aislado en rastrojo de soja (Glycine max L. Merr., variedad Nidera5909rr1) y M. phaseolina FCQ9, aislado de la base del tallo de sésamo (Sesamun indicum L, variedad Escoba blanca); ambos aislamientos fueron conservados en glicerol al 80% a 4 °C. Los hongos pertenecen al cepario micológico del Departamento de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Nacional de Asunción.

Para el mantenimiento de los hongos y para los ensayos de confrontación directa y antibiosis, se utilizó el medio de cultivo agar papa dextrosa (PDA), mientras que, para el análisis del perfil de proteínas y del perfil de metabolitos, se utilizó el medio líquido caldo papa dextrosa (PDB) (Beever y Bollard, 1970).

Para la obtención del perfil de proteínas y metabolitos secundarios de Trichoderma, se inocularon dos discos de micelio de 5 mm de diámetro de cada hongo, en matraces Erlenmeyer conteniendo 100 ml de medio PDB, y se incubó durante 120 h en condiciones estáticas, de oscuridad y a 30 °C, los análisis se realizaron por triplicado para cada especie. El control negativo fue PDB sin inocular, mantenido en las mismas condiciones que los medios inoculados con el hongo.

Ensayo de confrontación directa y antibiosis

Las tres especies de Trichoderma y los aislamientos de M. phaseolina, se sembraron y mantuvieron en medio de cultivo PDA en oscuridad a 30 °C, con el fin de preparar el pre-inóculo a utilizar en las pruebas de confrontación directa. Estas pruebas se realizaron mediante la técnica de cultivo dual, para lo cual se prepararon placas con medio PDA, en las cuales se colocaron en un extremo un disco de agar de 5 mm de diámetro con micelio del fitopatógeno (M. phaseolina), y en el extremo opuesto otro disco de 5 mm con micelio del antagonista (T. arundinaceum, T. brevicompactum o T. harzianum,); como controles, en placas separadas se sembró un disco de micelio de cada hongo (Figura 1A y 1B). Todas las placas se incubaron a 30 °C en oscuridad por cinco días, tiempo después del cual se hicieron mediciones del crecimiento radial cada 24 h, para posteriormente obtener el porcentaje de inhibición de crecimiento radial (PIC) con respecto al control. Todos los experimentos se realizaron por triplicado.

Figura 1

Figure 1. Direct confrontation assay antagonist-pathogen of three species of Trichoderma against M. phaseolina. A and B Scheme of the experiment of direct confrontation for the control and for the confrontation, respectively. Universidad Nacional de Asunción, Paraguay. 2015.

Confrontación directa de Trichoderma contra M. phaseolina

En los ensayos de confrontación se observó que las tres cepas de Trichoderma inhibieron el crecimiento de ambos aislados de M. phaseolina (Figura 2).

Figura 2

Figure 2. Direct confrontation assay antagonist-pathogen of three species of Trichoderma against M. phaseolina. Representative images of the direct confrontation assay at 96 h of interaction of T. arundinaceum (Ta); T. brevicompactum (Tb) and T. harzianum (Th) with M. phaseolina isolated from soy (FCQ6) and from sesame (FCQ9). Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Nacional de Asunción, Paraguay. 2015.

En general, las tres especies de Trichoderma empleadas en este trabajo inhibieron de forma significativa el crecimiento de los dos aislados de M. phaseolina en los ensayos de confrontación directa, membrana de celofán y/o membrana de diálisis.

Mediante el ensayo de confrontación directa hubo capacidad biocontroladora de las tres cepas de Trichoderma evaluadas, contra ambos aislados de M. phaseolina. Otras cepas de T. harzianum han demostrado previamente su eficacia en la inhibición de M. phaseolina (Khalili et al., 2016), sin embargo, no se encontraron referencias previas que describan el biocontrol ejercido por T. brevicompactum y T. arundinaceum contra M. phaseolina.

Con respecto a la especificidad de la interacción entre las especies de Trichoderma probadas y M. phaseolina, se observó que el aislamiento proveniente de sésamo (FCQ9) fue el más sensible al enfrentarse a T. arundinaceum; dicho efecto fue más evidente a las 96 h. Se ha descrito que la variabilidad genética de M. phaseolina está relacionada con el origen geográfico y del hospedero, condición que puede afectar tanto a la morfología como a los procesos biológicos del fitopatógeno (Baird et al., 2010; Arias et al., 2011; Mahdizadeh et al., 2011; Khan et al., 2017), lo que explica la distinta respuesta observada ante una misma situación de estrés, como pudo ser la exposición a agentes de biocontrol.

La evaluación de la naturaleza química de las moléculas responsables de la actividad antifúngica, reveló que las moléculas de alto y bajo peso molecular secretados por las tres especies de Trichoderma mantuvieron 100% de PIC hasta las 72 h de exposición para ambos aislados de M. phaseolina; de esta manera, la presencia de ambos tipos de moléculas secretadas al medio de cultivo se asociaron con mayor antibiosis. A las 120 h del experimento con membranas, las moléculas de bajo peso molecular secretadas por T. harzianum y T. brevicompactum mostraron una menor actividad antifúngica sobre el aislado de sésamo, por lo que, puede inferirse que las moléculas de alto peso molecular secretadas por Trichoderma al medio fueron un factor importante en su actividad antifúngica.

Hubo diferente complejidad del perfil proteico de las proteínas secretadas por las tres especies de Trichoderma, y según los resultados de actividad antifúngica obtenidos, las proteínas secretadas por T. harzianum y T. brevicompactum, tuvieron un rol importante en la inhibición del crecimiento del fitopatógeno M. phaseolina aislado de sésamo, considerando los resultados obtenidos a las 120 h en el experimento con membranas de celofán y diálisis.

El análisis por CCF mostró la presencia de varios compuestos en los extractos orgánicos de Trichoderma, de los cuales podrían ser responsables de la antibiosis observada con membrana de diálisis. La actividad antifúngica de los metabolitos secretados por T. harzianum y detectados en el presente trabajo, ha sido evaluada previamente contra varios fitopatógenos, entre ellos M. phaseolina, y la 1,8-dihidroxi-3-metilantraquinona, es la que ha demostrado una mayor capacidad de inhibición del crecimiento fúngico (Ahluwalia et al., 2015). Las proteínas secretadas por T. harzianum han sido analizadas en diferentes medios de cultivo por diferentes autores (Suárez et al., 2005; Monteiro et al., 2010), y se observa un perfil similar al que se obtuvo en el presente trabajo. Por otro lado, en trabajos previos se ha confirmado la producción de proteínas con actividad hidrolítica como endoglucanas, celulasas y xilanasas (Gómez-Mendoza et al., 2014), proteasa aspártica (Suárez et al., 2005) y quitinasas (Nagy et al., 2007), enzimas involucradas en la antibiosis ejercida por Trichoderma spp. (Harman, 2006). También se ha detectado y descrito actividad de proteasas en medios de cultivos mínimos sin estímulos, en los cuales ha crecido T. harzianum (Ramada et al., 2016).

Respecto al perfil de proteínas secretadas por T. brevicompactum, se detectó un menor número de bandas, proteínas que podrían estar involucradas en la antibiosis. Se ha descrito que proteínas secretadas por T. brevicompactum al medio de cultivo poseen actividad β-1,3- y β-1,4- glucanasa, y son capaces de degradar la pared celular de fitopatógenos (Ayoubi et al., 2014); en las condiciones experimentales del presente trabajo, estas proteínas podrían estar presentes y haber sido secretadas al medio. En T. brevicompactum es característica la producción de la micotoxina trichodermina (Nielsen et al., 2005), sin embargo, en las condiciones de cultivo empleadas en este trabajo no se detectó su presencia.

Trichoderma arundinaceum inhibió en alto porcentaje (100%) el crecimiento (PIC) de M. phaseolina aislado de sésamo hasta las 96 h, en el ensayo de confrontación directa y de membranas. Resultados similares se han obtenido al evaluar el crecimiento de Botrytis cinerea Pers. y Rhizoctonia solani J.G. Kühn por cepas silvestres y mutantes de T. arundinaceum, siguiendo el mismo método (Malmierca et al., 2012). En el análisis químico del extracto de T. arundinaceum, se destacó la presencia del metabolito harzianum A, el cual ha sido previamente descrito en este hongo (Corley et al., 1994) y del que se conoce que es una potente micotoxina perteneciente a la familia de los trichotecenos (Lee et al., 2005); además, en Trichoderma spp. se ha descrito la presencia de péptidos con actividad antibiótica, cuyo peso molecular varía entre 500 y los 2200 Da (Degenkolb et al., 2003), mismos que podrían ejercer la antibiosis junto con los metabolitos en el ensayo de membrana de diálisis.

Para T. arundinaceum, los resultados de crecimiento sobre membrana no permitieron demostrar la contribución de las proteínas secretadas y detectadas en el perfil proteico, debido a la elevada actividad antifúngica de las moléculas de bajo peso molecular secretados por el agente de biocontrol, reflejados en el PIC 100% de los experimentos con membrana de celofán y diálisis. Estos resultados coinciden con los obtenidos por Malmierca et al. (2012) para R. solani, y contrastan con los obtenidos por los mismos autores para B. cinerea, en donde el PIC en membrana de celofán fue significativamente mayor que en diálisis, demostrando la importancia de las proteínas secretadas en la antibiosis contra B. cinerea.

Las tres especies de Trichoderma empleadas inhibieron de forma significativa el crecimiento de ambos aislados de M. phaseolina. Estas especies son capaces de biosintetizar varias moléculas de alto y bajo peso molecular que están implicadas en el efecto antagónico y de antibiosis observado contra los dos aislamientos de M. phaseolina. Este trabajo constituye la primera descripción de la actividad antifúngica de T. brevicompactum y T. arundinaceum contra M. phaseolina.