La rosa (Rosa hybrida) es una de las principales especies ornamentales en el mundo. El cultivo se realiza para tres fines principales: flor de ornato, productos cosméticos y alimenticios. Aparte del uso ornamental, los principales productos son agua de rosa, rosa en conserva y aceite de rosa, los cuales tienen un alto valor en el mercado internacional (Baig et al., 2011).

La demanda en el consumo de rosa ha aumentado y por ello, se requiere incrementar las zonas de producción; así, la superficie mundial de plantas cultivadas y de macetas ascendió a 702 400 ha en 2010, de la cual México ocupó el cuarto lugar (Domínguez-Serrano et al., 2016). El establecimiento de estacas llega a ser exitoso en un 60% en sustrato y dura más de veinticinco días (Cárdenas-Navarro y López-Pérez, 2011). El cultivo de yemas, brotes, callos y nodos son las técnicas más empleadas para la propagación in vitro de las rosas. La optimización de dichas técnicas de cultivo permite producir gran cantidad de plantas enraizadas (hasta un 90%) en un corto tiempo (hasta quince días), lo que contrasta con las técnicas de injerto que requieren de mayor inversión de tiempo, además, aseguran la calidad fitosanitaria y ventajas ante ciertas características edáficas desfavorables (Das, 2010).

La regeneración de plantas a partir de callos embriogénicos cultivados se ha reportado en periodos largos de subcultivo, por doce meses (Li et al., 2002), 36 meses (Zakizadeh et al., 2008) y hasta 70 meses (Kamo et al., 2005). Sin embargo, la obtención de material vegetal a partir de callos subcultivados puede venir acompañada de variación somaclonal (anormalidades fenotípicas y genotípicas) en plántulas regeneradas ante la continua manipulación de los tejidos in vitro (Zakizadeh, 2008); además, la capacidad embriogénica se reduce debido a la pérdida de totipotencia (Benson, 2000; Jha, 2004).

La proliferación de yemas en rosa es una tarea sencilla, sin embargo, el enraizamiento in vitro es complicado (Salekjalali et al., 2011), debido a que es altamente dependiente del genotipo (Arnold et al., 1995) y la concentración de sales como las Van der Salm (Davoudi et al., 2015) en el medio de cultivo Murashige y Skoog (1962), conocido como MS. Otros factores que afectan el enraizamiento in vitro son la aplicación de bajas temperaturas en condiciones de oscuridad y la auxina utilizada (Pati et al., 2006). Se ha reportado enraizamiento de un promedio de 50% en medio MS al 50% de su concentración (Ozel y Arslan, 2006; Ambros et al., 2016), y más del 90% en MS al 50% suplementado con 2 mg/l de ácido indol butírico (IBA) (Salekjalali et al., 2011). Por otro lado, Korban et al. (2006) recomendaron usar MS al 100%, suplementado con vitaminas MS y 30 g/l de sacarosa.

Las rosas tienen una fuente de genes limitada (Rajapakse et al., 1992; Vainstein y Ben-Mehir, 1994). El cultivo de tejidos permite la transformación genética así como el cultivo de embriones poco viables. El empleo de estas técnicas permite incrementar el material genético de manera artificial, lo que no se logra de manera natural (Abdolmohammadi et al., 2014; Li et al., 2002). Por otra parte, el sistema hidropónico permite mayor productividad, menor consumo de agua (17% menos requerimiento de agua) y calidad que el cultivo en suelo abierto (Singh, 2017). La técnica de microponía consiste en suministrar los nutrientes en solución mediante diversos materiales empleados como sustrato; es una combinación de hidroponía y aclimatación ex vitro (Nhut et al., 2005; Sallanon et al., 1998; Wang et al., 2012), y puede permitir un mayor desarrollo vegetal en comparación con la aclimatación en medio líquido y sólido (Thien-Nghia et al., 2017). Las principales dificultades de esta técnica son contaminación de las soluciones nutritivas, manejo de pH (Nhut et al., 2005), y la adquisición de apariencia vidriosa (vitrificación) debido a la alta humedad (Thien-Nghia et al., 2017; Scheneider, 2005; Wang et al., 2012). La alta luminosidad y el alto potencial osmótico reducen la adaptabilidad de las plántulas a condiciones ex vitro (Sallanon et al., 1998).

Para el cultivo de la rosa se requiere de investigación sobre la aclimatación en medio líquido y evaluar la oxigenación, con el fin de evitar la necesidad de una previa aclimatación en sustrato sólido, lo cual supone un menor costo y una directa incorporación en sistema hidropónico. Las plantas obtenidas in vitro no tienen un buen funcionamiento de estomas, por lo tanto, tienen baja asimilación de dióxido de carbono (Sallanon et al., 1998). La consecuente exposición al ambiente debe ser cuidadosa para evitar mermas en las plantaciones.

El humus de lombriz (Eisenia foetida Savigny) también ha sido empleado en diferentes proporciones para la aclimatación de Aloe vera (L.) Burm. F. (Vilchez et al., 2007), Morus alba L. (Salas et al., 2011), Anthurium andreanum Linden ex André (Martin et al., 2003), Tylophora indica (Burm f.) Merril (Rani y Rana, 2010) y Saccharum officinarum (L.) (Díaz et al., 2004). Sin embargo, el compost debe tener un alto índice de humedad y materia orgánica para favorecer una buena colonización microbiana y prevenir el ataque de hongos fitopatógenos (Hoitink et al., 1996). El aporte de ácidos húmicos en la solución de riego puede incrementar la translocación de nutrientes a las hojas, y así beneficiar la vida de anaquel de la flor cortada para el caso de cultivo de rosa en hidroponía; además, se incrementa la toma de nutrientes (Dastyaran, 2015). Los sustratos formulados con compostas y otros materiales, son considerados satisfactorios para la aclimatación de rosa micropropagada. Se propone que el uso de vermicomposta beneficie el desarrollo vegetal y permita reducir el uso de la turba de musgo (peat moss), debido a que este recurso se considera limitado en la naturaleza.

Se desconoce la capacidad en la proliferación de raíces de brotes de rosa transgénica proveniente de callos cultivados por dos años en medios de enraizamiento, el efecto de la aplicación del humus de lombriz en diferentes proporciones como parte de sustrato ex vitro para aclimatar y enraizar brotes de rosa transgénica procedente de cultivos de tejido de dos años.

Existe desconocimiento sobre el efecto del sistema flotante hidropónico con y sin oxigenación activa como parte de sustrato ex vitro para una adecuada aclimatación y enraizamiento de brotes de rosa transgénica procedente de cultivos de tejido de dos años.

El objetivo de esta investigación fue evaluar tres medios de enraizamiento in vitro y diferentes sustratos para la aclimatación ex vitro mediante medios sólidos y líquidos de la rosa transgénica.

Material biológico utilizado

Se utilizaron brotes de Rosa hybrida transgénica cv. Classy procedentes de callos embriogénicos cultivados por dos años y multiplicados en el medio de cultivo recomendado por Korban et al. (2006). Se eligieron rosas con ápices activos, buena apariencia y sin enraizar para dos experimentos separados: (1) enraizamiento in vitro y (2) enraizamiento y aclimatación simultánea ex vitro.

Experimento de enraizamiento in vitro

El trabajo se realizó de agosto del 2012 a enero del 2013, en las instalaciones del Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco, A.C. (CIATEJ), ubicado en la ciudad de Guadalajara, Jalisco, México. Para este experimento, se utilizaron brotes que se cortaron en su base antes de ser establecidos en medio de enraizamiento. Se utilizaron frascos con una longitud de 12 cm y un diámetro de 4,8 cm en los que se vertieron 15 ml de medio para enraizamiento. Se eligieron explantes con una longitud promedio de 1,25 cm y seis hojas por planta.

Se colocó un explante por frasco, y se incubaron en condiciones de fotoperiodo de 16 h de luz y 8 h de oscuridad, con una intensidad de luz de 1200 luxes y una temperatura de 21 ºC durante tres semanas. Se utilizó el medio basal MS a diferente concentración según los medios empleados por Korban et al. (2006) (K), Ozel y Arslan (2006) (OA) y Salekjalali et al. (2011), los cuales tuvieron como constantes los parámetros de 2,5 g/l de gelrite gellan gum, concentración de 100% de vitaminas MS y pH de 5,7. Los factores variables de los medios de cultivo fueron la concentración de sales MS (Murashige y Skoog, 1962), sacarosa, ácido indol butírico y carbón activado, los cuales se aplicaron solamente en los tratamientos K y S, respectivamente (Cuadro 1).

Cuadro 1

Table 1. Composition of in vitro rooting media evaluated in Rosa hybrida L. cv. Classy. Guadalajara, Mexico. 2012-2013.

Enraizamiento in vitro

Puntajes de calidad de planta

Los resultados de la evaluación de la calidad de la planta a los siete días posteriores de su traspaso a los sustratos o medios de enraizamiento (Cuadro 1), indicaron que los tratamientos K y OA obtuvieron un puntaje promedio de 7 de un máximo de 9 (Cuadro 4). No obstante, el desarrollo de las plantas se vio afectado en los días siguientes (decremento de puntaje 7 a 5 a los catorce días en los tratamientos K y OA, y de 5 a 3 en el tratamiento S), y se observó estable a los veintiún días en los medios K y OA.

Número de hojas por planta

Los resultados obtenidos a los siete días indicaron que el tratamiento (K) tuvo un promedio de 7,4 hojas por planta, mientras que el tratamiento OA obtuvo el mayor promedio alcanzando (8,8 hojas por planta) (Cuadro 1). A los veintiún días todas las plantas de los tres tratamientos presentaron una disminución en el número de hojas, a la mitad de la observada a los siete días.

Porcentaje de enraizamiento

Solo el 60% de las plantas del medio (K) enraizaron a los treinta días, mientras que, en los demás tratamientos se manifestó mortalidad en las plantas, sin desarrollo alguno de raíz. El tercer tratamiento (S) presentó desarrollo de callosidad en la base de los explantes, pero nula presencia de raíces.

Enraizamiento y aclimatación ex vitro

Puntajes de calidad de planta

A los cuatro días, los tratamientos T1, T4 y T6 alcanzaron 5 puntos en promedio, lo que indica mayor follaje verde que hojas amarillentas (Cuadro 4). El resto de los tratamientos presentaron puntajes inferiores: T2 con 3 puntos, lo que indicó un follaje relativamente sano con pocas manchas amarillentas y crecimiento reducido. Por otro lado, los tratamientos T7 y T5, a pesar de que también obtuvieron 3 puntos, presentaron menor desarrollo y muchas hojas muertas y amarillentas (Cuadro 5).

Cuadro 5

Table 5. Quality score of transgenic rose (Rosa hybrida cv. Classy) plants, in the substrate treatments in ex vitro acclimatization, evaluated throughout sixteen days of acclimatization. Guadalajara, Mexico, during the years 2012 and 2013.

Enraizamiento in vitro

Puntajes de calidad de planta

Los tratamientos de enraizamiento in vitro K y OA (Cuadro 1), obtuvieron los puntajes de calidades superiores de los tratamientos de enraizamiento in vitro (con tres y cinco), y resultaron superiores a los descritos por Scheneider (2005), al evaluar plántulas de Rosa spp en un periodo de cuatro a siete días después de establecerlas en medio sólido para enrizamiento enriquecido con 0,1 o 0,5 mg/l de AIB con puntajes de seis y tres, respectivamente.

Número de hojas por planta

Los tratamientos no mostraron diferencias significativas entre sí (p≤0,05) durante las dos primeras evaluaciones de número de hojas por planta (7 y 14 días, entre 7,4 y 8,8 hojas/planta) y después procedieron a tener un menor número de hojas, lo cual difiere a lo reportado por Scheneider (2005), quien mencionó que las plántulas presentaron una tendencia a aumentar su follaje. El número esperado de hojas fue mayor al que se había presentado a los primeros catorce días durante la tercera medición (que se realizó veintiún días después del enraizamiento in vitro).

Porcentaje de enraizamiento

Mejor sobrevivencia en condiciones ambientales y mayor porcentaje de plántulas enraizadas (90%) con medio MS al 50% generó su concentración y 2 mg/l de IBA, fueron obtenidos por Salekjalali et al. (2011); sin embargo, en el presente trabajo se observó una alta defoliación, bajo porcentaje de enraizamiento y desarrollo de callosidad. Dicho fenómeno afectó la absorción de agua y nutrientes (Davoudi et al., 2015), por lo tanto, inhibió el crecimiento de los brotes y una posible emisión de etileno en los tejidos.

Los explantes de cinco genotipos diferentes de rosa presentaron un menor porcentaje de enraizamiento a concentraciones en el medio mayores a 0,8 mg/l de AIB en una investigación realizado por Arnold et al. (1995), sin embargo, en el presente trabajo se utilizó una concentración de 2 mg/l, mientras que Schneider (2005) había observado desarrollo de callosidad a una concentración de 0,5 mg/l de IBA. Se ha observado un mayor porcentaje de explantes de rosa enraizados in vitro (cercanos al 90%) con la concentración 100% de sales MS en trabajos previos con bajas concentraciones de auxina (menores a 1 mg/ml) (Arnold et al., 1995). En otros estudios se encontraron enraizamientos de entre 90 y 83% en explantes de dos diferentes cultivares a una concentración de 50% de medio MS y 0,5 mg/l de AIB (Baig et al., 2011), y de 90% en un medio con un 25% de concentrado de sales MS y 0,25 mg/l de AIB en cv. Landora (Das, 2010).

Enraizamiento y aclimatación ex vitro

Puntajes de calidad de planta

Los tratamientos T1, T6 y T4 alcanzaron el mayor puntaje de calidad de planta, lo cual contrasta con los resultados de las evaluaciones desarrolladas por Díaz et al. (2004), quienes a distintas concentraciones de humus (0, 20, 40, 60, 80 y 100%) en la aclimatación ex vitro de Saccharum spp., observaron mejor desarrollo vegetal y menor incidencia de infecciones en ausencia de humus, en cambio, la longitud de raíces fue beneficiada a medida que la cantidad de vermicomposta aumentaba.

Número de hojas por planta

Los tratamientos T1, T2 y T6 mantuvieron mayor follaje que los otros cuatro tratamientos, de manera similar a los puntajes de calidad de planta, similar a lo obtenido por Schneider (2005), quien observó un mayor contenido de follaje a mayor concentración de turba de musgo (peat moss). Los tratamientos con mayor cantidad de humus (T4 y T5) no presentaron follaje alguno a dieciséis días de iniciado el experimento, contrario a los resultados de otras investigaciones donde los tratamientos con vermicomposta permitieron la generación de mayor número de hojas por planta en Aloe vera (Vilchez et al., 2007) y en Tylophora indica (Rani y Rana, 2010).

Rango de sobrevivencia de plantas

Los resultados de sobrevivencia estimada en un 60% para los T1 y T2, coincidieron con lo reportado por Zakizadeh et al. (2008), quienes aclimataron en turba plántulas de rosa procedentes de callos cultivados por 36 meses. Por otro lado, se han encontrado distintos índices de sobrevivencia con el uso de compostas en la aclimatación de rosa que varían entre 60% (Das, 2010) y 80% (Xing et al., 2009), lo cual no sucedió a los dieciséis días después del establecimiento del presente experimento. En la aclimatación de plántulas de Gypsophila paniculatta en hidroponía con el empleo de sesenta brotes por unidad experimental, se reportó una sobrevivencia del 80% a los treinta días después del establecimiento (Wang et al., 2012). A diferencia de este estudio, el tratamiento 6 de hidroponía del presente experimento mostró un 40% de sobrevivientes a los dieciséis días; además se utilizó un brote por unidad experimental.

Contenido de clorofilas a, b y carotenos

Los contenidos de clorofila fueron mayores en sustrato con peat moss 70% + perlita 30% (0,436 mg/g en peso fresco en clorofila a, y 0,816 mg/g en peso fresco en clorofila b) que en medio líquido sin oxigenación (clorofila a 0,341 mg/g, clorofila b a 0,654 mg/g en peso fresco), los cuales fueron similares a los resultados reportados por Schneider (2005) en Rosa sp. Los cocientes de clorofila a/b fueron muy similares en todos los tratamientos, valores considerados muy bajos, por lo que, las plantas presentaron un estrés (Barber, 1994; Shaw, 1995). Es posible que la adaptación de las plantas lleve mayor tiempo, debido a que el control estomático es nulo (Sallanon et al., 1998). Se reportan valores de cociente clorofila a/b mayores a 2 para plántulas micropropagadas de vid bajo condiciones de baja intensidad de luz (2960 luxes) y de alrededor de 4 en alta intensidad de luz (6660 luxes) (Amancio et al., 1999).

Según un estudio, la actividad fotosintética (medición de fluorescencia de clorofila) fue menor (hasta en un 100%) en condiciones de alto potencial osmótico (-0,3 MPa), comparado con el testigo (-0,05 MPa) a partir de una intensidad de 7400 luxes (Sallanon et al., 1998). En el presente estudio, se utilizó una intensidad de 1200 luxes y la solución de Steiner, lo cual resultó menor a lo reportado.

Porcentaje de enraizamiento

El porcentaje de plantas enraizadas fue muy bajo, solo el 20% de las plantas enraizaron en T1 (0% humus), lo cual puede relacionarse con el hecho de que se cultivó con varios medios. Las plantas obtenidas por regeneración de callos de distintos periodos de tiempo, por lo general, se aclimatan y enraizan exitosamente en sustratos con turba (Murali et al., 1996; Li et al., 2002; Zakizadeh et al., 2008), con porcentajes de enraizamiento mayores al 90%; no obstante, el enraizamiento puede no presentarse (Rout et al., 1991) o conseguirse después de hacer cultivo con al menos dos medios diferentes (Jabbarzadeh y Kosh-Khui, 2005).