El uso de hongos entomopatógenos en la agricultura como biopesticidas para plagas invertebradas, ha tomado un rol importante dentro de los programas de manejo agronómico (Keswani et al., 2016). Cuando se realizan ensayos en campo, bajo estructuras de ambiente controlado o de manera in vitro, la investigación está dirigida a entender el comportamiento de las poblaciones, tanto del artrópodo como del hongo o de los hongos controladores utilizados y su relación directa con otros factores externos que intervienen en el proceso de parasitismo del hongo sobre la plaga. Sin embargo, es de suma importancia entender las relaciones de las características geográficas y genéticas que existen en los hongos controladores.

Tradicionalmente, las características micro y macroscópicas han sido los criterios utilizados para la diferenciación de hongos entomopatógenos. Además, las características registradas a nivel de campo, tales como ubicación geográfica, condiciones climáticas, hábitat, sistema de cultivo y propiedades del suelo, son factores que inciden en la caracterización de cepas (Sánchez-Peña et al., 2011; Toledo et al., 2013).

En la actualidad, investigadores han obtenido una mayor información acerca de los controladores biológicos, mediante técnicas moleculares que analizan los perfiles genéticos que permiten elaborar dendrogramas para revelar sus relaciones genéticas de manera más objetiva. Las empresas interesadas en biopesticidas buscan la protección de propiedad intelectual. Asimismo, muchos países ricos en diversidad están protegiendo sus recursos biológicos por medio de leyes estrictas. Esto enfatiza la importancia de entender las relaciones genéticas y la diversidad alélica particular de aislamientos entomopatógenos.

Una manera efectiva de caracterizar la diversidad para la protección de recursos biológicos, es por medio de marcadores moleculares. En Metarhizium y Beauveria se han aplicado marcadores moleculares tipo amplificación aleatoria de ADN polimórfico (RAPD, por sus siglas en inglés), y repetición de secuencias discretas (SSR, por sus siglas en inglés) o microsatélites (Castrillo et al., 2003; Rehner y Buckley, 2003; Aquino-De-Muro et al., 2005; Becerra-Velásquez et al., 2007; Freed et al., 2011; Zhang et al., 2016). Aunque cualquiera de estos sistemas de marcadores es efectivo para caracterización, los RAPD, ISSR y AFLP amplifican numerosos segmentos desconocidos y, rara vez, generan perfiles genéticos exclusivos a un individuo. Sin embargo, los SSR son segmentos del genoma conservados a nivel de género (y en algunos casos a nivel de familia) en organismos eucariontes, y se encuentran en el genoma nuclear y citoplásmico (FitzSimmons et al., 1995; Decroocq et al., 2003; Barbará et al., 2007; Hu et al., 2009). También, los SSR son segmentos de ADN con secuencia conocida y son sumamente informativos cuando se revelan varios SSR, puesto que generan perfiles casi exclusivos a un solo individuo; una probabilidad de 10-15 de repetirse en dos individuos no relacionados de manera aleatoria (Carracedo y Sánzhez-Diz, 2005). Esto hace a los SSR particularmente útiles para la protección de recursos genéticos, así como la caracterización genética. Cebadores para amplificar SSRs en Beauveria han sido diseñados a partir de un aislamiento de B. bassiana de la Costa de Marfil, y sus motivos repetitivos son simples de dos o tres nucleótidos (Rehner y Buckley, 2003; Meyling et al., 2012). Métodos similares también han sido utilizados para diseñar cebadores que amplifiquen SSRs en Metarhizium, basados en un aislamiento de M. anisopliae (cepa ARSEF 7524) por Oulevey et al. (2009), pero sus motivos repetitivos son complejos.

Algunos autores han podido relacionar la especificidad del hospedero a nivel de orden a cepas de Metarhizium exclusivamente de origen tropical (St Leger et al., 1992; Bridge et al., 1997; Leal et al., 1997), sin embargo, estudios recientes no han encontrado ningún tipo de correlación entre la especie hospedera y especies o genotipos de Metarhizium (Bischoff et al., 2009; Freed et al., 2011; Bautista-Glavez et al., 2012). Al analizar aislamientos de Metarhizium de origen panameño, tampoco se encontró correlación con la diferenciación genética de los aislamientos y su ubicación geográfica, ni hubo especificidad con el hospedero (Hughes et al., 2004). Esto concuerda con estudios de diversidad genética y geográfica de Metarhizium en China (Zhang et al., 2016), México (Hernández-Domínguez et al., 2016), y otras partes del mundo (Bischoff et al., 2009; Nishi et al., 2011), y la mayoría de estos estudios apoyan una hipótesis de, o sugieren que hay, diversificación por tipo de hábitat.

Para la protección de propiedad intelectual y el conocimiento de la diversidad genética de los hongos entomopatógenos, el objetivo de este trabajo fue analizar la diversidad alélica y las relaciones genéticas y geográficas de la colección de aislamientos de Beauveria y Metarhizium del Departamento de Investigación y Extensión de la Caña de Azúcar (DIECA) de la Liga Agrícola Industrial de la Caña de Azúcar (LAICA).

Aislamientos

Se analizaron trece aislamientos de Metarhizium y catorce de Beauveria de la micoteca de DIECA, de LAICA, Costa Rica, entre los años 2014 y 2015. La mayoría de los aislamientos de Metarhizium provinieron de insectos recolectados en plantaciones de caña de azúcar en diferentes regiones de Costa Rica (Cuadro 1). Los aislamientos de Beauveria se obtuvieron de diferentes insectos de diversos cultivos. En algunos casos los aislamientos del hongo entomopatógeno fueron originarias de estaciones de investigación de Brasil (Cuadro 1). Algunos aislamientos se inocularon sobre insectos de interés para realizar un proceso de revigorización de la actividad patogénica del hongo. Los aislamientos se mantuvieron en placas de agar papa dextrosa (PDA).

Cuadro 1

Table 1. Beauveria (DB1 to DB14) and Metarhizium (DM1 to DM12 and Ma12) isolate codes, geographic origin and insect hosts. Isolates provided by Departamento de Investigación y Extensión de la Caña de Azúcar (DIECA) of Liga Agrícola Industrial de la Caña de Azúcar (LAICA), Costa Rica. 2014-2015.

Análisis de microsatélites

Los doce pares de cebadores para amplificar microsatélites en Beauveria generaron un producto de PCR en al menos una de las muestras de ADN extraídos a partir de los aislamientos (Cuadro 2). Sin embargo, de los trece pares de cebadores para amplificar microsatélites en Metarhizium, ocho pares generaron un producto en al menos una de las muestras de ADN (Cuadro 2). El par de cebadores que reveló la mayor cantidad de alelos fue Ba06 (seis alelos), seguido por los pares Ba02, Ba08, y Ba17 (Cuadro 2; Figura 1). Sin embargo, el par más informativo fue Ba02 (PIC = 0,63). En total, estos cuatro juegos generaron veintiún alelos distinguibles. A pesar de tener un valor menor a 0,50 (PIC = 0,37), el par de cebadores Ba16 generó alelos que permitieron diferenciar varios aislamientos. Aun considerando todos los pares de cebadores de Beauveria, no fue posible generar perfiles genéticos únicos para cada aislamiento. Ocho de los quince aislamientos analizados tuvieron perfiles genéticos únicos, mientras que los siete restantes compartieron perfiles con uno o dos de los otros aislamientos (DB1, DB2, DB3, DB5, DB6, DB7, y DB9).

Cuadro 2

Table 2. Beauveria and Metarhizium microsatellite molecular markers (SSR) tested in polymerase chain reactions using genomic DNA extracted from a fungal library of the Departamento de Investigación y Extensión de la Caña de Azúcar (DIECA) of Liga Agrícola Industrial de la Caña de Azúcar (LAICA), Costa Rica, 2014-2015.

Análisis de microsatélites

Este estudio reporta alelos de peso molecular que serán útiles para otros estudios de diversidad en el trópico, aunque principalmente para Beauveria. Los cebadores para amplificar microsatélites en ADN de Beauveria desarrollados por Rehner y Buckley (2003) y Meyling et al. (2009; 2012) lograron amplificar los SSR de al menos uno de los aislamientos de Beauveria. A pesar de que Oulevey et al. (2009) realizaron un método similar a Meyling et al. (2009), la amplificación de productos de PCR con el uso de ADN de los aislamientos de este estudio no fue exitosa para varios pares de cebadores. Esto implica que hay segmentos no complementarios con los cebadores en el ADN de aislamientos de Metarhizium, que impidió la hibridación del cebador o que la adición del cebador universal M13 para marcar los productos interfirió en la amplificación. Sin embargo, el método M13 de Schuelke (2000) fue exitoso en las reacciones de PCR para todos las pares de cebadores de Beauveria, lo que sugiere que el ADN de los aislamientos de Metarhizium contiene segmentos no complementarios a los cebadores. Otros autores también han notado la pobre diversidad alélica de microsatélites en aislamientos de Metarhizium originarios de países de Asía y Europa (Freed et al., 2011), y de Chile (Becerra-Velásquez et al., 2007), a pesar de contener secuencias repetidas complejas, donde se esperaría observar diversidad alélica.

Los pares de cebadores de los marcadores Ba02, Ba06, Ba08 y Ba17, serían útiles para la protección de recursos biológicos y para estudios de diversidad, ya que generaron veintiún alelos diferentes en los aislamientos de este estudio y se asociaron a un valor PIC mayor a 0,60. Si se considera también el par de cebadores del marcador Ba15 (PIC = 0,58), se podrían generar hasta veinticuatro alelos diferentes. Para propósitos de identificar cada aislamiento de este estudio, se podrían utilizar los cebadores de los marcadores B02, B06, B08, Ba16 y Ba17. Sin embargo, no se podría distinguir entre los aislamientos DB1 y DB6; DB2, DB3 y DB7; y entre DB5 y DB9. Esta limitante, en parte, se debe a la naturaleza haploide de Beauveria, puesto que se puede asociar un solo alelo por locus por aislamiento. También es necesario considerar la naturaleza mitospórica del hongo, en otras palabras, es posible encontrar aislamientos genéticamente idénticos. Por lo tanto, es necesario evaluar un mayor número de marcadores para lograr una identificación a nivel de aislamiento y así, considerar otros métodos para descartar aislamientos repetidos de la colección.

Esta diversidad alélica no se observó para aquellos marcadores reportados por Oulevey et al. (2009). Solo uno de los pares de cebadores superó un valor PIC de 0,25, lo cual es considerado poco informativo (Botstein et al., 1980). Otros pares de cebadores se tendrían que evaluar para objetivos similares de protección de material biológico y de análisis de diversidad de Metarhizium, al menos para el caso de estos aislamientos tropicales. Para lograr mejorar este tipo de aplicación es necesario un análisis de prueba de un mayor número de marcadores tipo SSR o aplicar otra tecnología de marcadores como polimorfismo de nucleótido único (SNP, por sus siglas en inglés), ya que se ha encontrado una diversidad alélica pobre por medio de SSR por varios autores, incluyendo este estudio.

Relaciones genéticas y geográficas

Con base en solo dos clados principales en los aislamientos de Beauveria y considerando que cada clado fue genéticamente distante, los grupos no presentaron tendencias ni correlaciones genéticas con el insecto hospedero. Esto refleja principalmente la naturaleza cosmopolita de Beauveria y sugiere que la especificidad de hospedero de Beauveria es una característica poligénica (Meyling y Eilenberg, 2007). Similarmente, Garrido-Jurado et al. (2011) no encontraron correlaciones con la diversidad genética de 53 aislamientos españoles de B. bassiana y el hospedero de origen. La diversidad de los aislamientos de Beauveria se puede explicar por barreras o componentes geográficos, pero solo explica parcialmente la variabilidad (26%). Se especula que esto es porque dos aislamientos provenientes de Brasil formaron uno de los clados (DB12 y DB14), con la excepción de DB4. Si se considerara que, las distancias entre sitios muestreados dentro de Costa Rica fueron relativamente cortas, sería necesario muestrear sitios intermedios entre Costa Rica y Brasil para establecer un modelo con mayor R cuadrado y así, sustentar una hipótesis que mejor explique la variabilidad genética de los aislamientos por sus ubicaciones geográficas.

Se ha demostrado, en otros estudios, que las distancias geográficas influyen sobre las distancias genéticas de aislamientos provenientes de Brasil y EEUU (Fernandes et al., 2009). Secuenciación de genomas completos mitocondriales y las regiones variables intergénicas (ITS1-5.8s-ITS2) de 76 aislamientos, revelaron que la variabilidad genética de B. bassiana s.l. estuvo fuertemente correlacionada a factores climáticos (Ghikas et al., 2010). Otros estudios también han encontrado este hallazgo en B. bassiana (Wang et al., 2003; Hadapad et al., 2006; Garrido-Jurado et al., 2011). Los resultados de este estudio concordarían con una hipótesis de correlación geográfica o climática con la diferenciación genética en Beauveria, sin embargo, solo se demostró a nivel de género.

La prueba de Mantel no tuvo significación para la correlación de las relaciones genéticas con las distancias geográficas en Metarhizium. Fue difícil establecer correlación entre el hospedero y las relaciones genéticas, puesto que hubo tres especies de insectos hospederos de Hemíptera. Sin embargo, Mal12 fue el único aislamiento encontrado en una familia hospedera diferente (Aleyrodidae). Estos hallazgos reflejaron la naturaleza generalista reportada para Metarhizium (Bischoff et al., 2009; Freed et al., 2011; Bautista-Glavez et al., 2012).

Los resultados obtenidos implican enfocar nuevas búsquedas de aislamientos de Beauveria en diferentes hábitats o ecosistemas, y esperar que la distancia geográfica incida sobre su diversidad. Para el caso de Metarhizium, el panorama aún no queda claro, pero la literatura sugiere diversificación debido al ambiente. En ambos géneros de hongos no se puede esperar, en general, especificidad del genotipo o especie del hospedero.

Las relaciones genéticas de los aislamientos de Beauveria y Metarhizium de la colección de LAICA-DIECA se conforma por dos a tres grandes grupos genéticos, donde podrían existir accesiones genéticamente idénticas dentro de cada grupo. Mayor número de marcadores SSR serían necesarios para distinguir los aislamientos de Beauveria, mientras que otra tecnología de marcadores moleculares tendría que ser implementada en Metarhizium para entender mejor las relaciones genéticas y para identificar aislamientos. Las distancias geográficas explican, parcialmente, la diversidad genética de los aislamientos de Beauveria, no así para el caso de los aislamientos de Metarhizium. Varios marcadores tipo SSR de Beauveria fueron altamente informativos y lograron distinguir 57% de los aislamientos de la colección.