Las muestras de suelo se colectaron aleatoriamente en tres fincas productoras de cítricos ubicadas en el municipio de Caicedonia: Las Brisas, lote 14: 4° 23' 48.00" N 75° 50' 58.44" O a 1.067 msnm y lote 11: 4° 23' 29.93" N 75° 50' 42.59" O a 1.092 msnm; Casa Brava, lote 5: 4°21'48.72"N- 75°50'40.18"O a 1108 msnm; y El Recreo, lote 5: 4° 19' 31.63" N 75° 49' 29.88" O a 1.182 msnm.

De cada finca se seleccionaron diez sitios al azar y de cada uno se tomaron de tres a cinco muestras de suelo con un barreno de 10 cm de diámetro, a una distancia de 30 m aproximadamente, 30 cm de la base del tallo de los árboles y una profundidad 40 cm. Entre muestras, el barreno se limpió con agua y después se sumergió en una solución de hipoclorito de sodio (NaClO) al 5 % y se secó al aire para prevenir contaminación entre muestras. El suelo se mezcló completamente y se colocó en una bolsa plástica previamente rotulada con toda la información pertinente a cada muestra.

Las muestras de suelo de cada sitio se mezclaron y se procesaron diez submuestras de 300 g, con diez larvas de Diatraea saccharalis en último instar larval (Fabricius) (Lep: Pyralidae) como insecto-trampa y se almacenaron a temperatura ambiente (25 ± 3 ºC y HR 65 ± 5 %) durante siete días de acuerdo a la metodología de Zimmerman (1986). Cada muestra se procesó tres veces.

A partir de las larvas de D. saccharalis que se utilizaron como cebo, se seleccionaron las larvas que presentaron signos de infección por hongos entomopatógenos, se desinfectaron con hipoclorito de sodio al 1 % durante tres minutos y tres lavados con agua destilada estéril (ADE). Se secaron en toalla estéril, se sembraron en Sabouraud dextrose agar (SDA) en cámara de flujo laminar y se incubaron a 27 ºC durante siete días. Los hongos se aislaron y purificaron en (SDA) a 27 ± 2 °C bajo condiciones de luz natural. La identificación se realizó con el uso de claves taxonómicas de acuerdo a las características morfológicas de las conidias (Hanlin 1990; Barnett y Hunter 1998; Leslie y Summerell 2006). El almacenamiento se efectuó en glicerol al 10 % a 20 ºC. La producción masiva se realizó en el laboratorio en botellas con arroz precocido (Vélez et al. 1997).

Las muestras de suelo previamente humedecido de cada sitio se mezclaron y se tomaron diez submuestras de 300 g. A cada una se le adicionaron diez larvas de último instar larval de D. saccharalis y se almacenaron a temperatura ambiente (25 ± 3ºC y HR 65 ± 5 %) durante siete días de acuerdo al método descrito por Bedding y Akhurst (1975). Las larvas se revisaron cada dos días. Las larvas muertas de cada muestra se revisaron y se colocaron en trampas White para la colecta de los infectivos juveniles (IJS) y se reemplazaron por larvas sanas. Los IJS recuperados se decantaron tres veces con agua destilada estéril (ADE) y se desinfectaron con formaldehído al 0,001 %. Posteriormente, se sometieron a los postulados de Koch para comprobar su patogenicidad utilizando larvas sanas de último instar larval de D. saccharalis. La identificación de los nematodos entomopatógenos se realizó con la clave taxonómica de Kaya y Stock (1997).

Teniendo en cuenta que el tamaño de las conidias es una característica importante para la producción masiva, se seleccionaron dos aislamientos de cada género de hongo, uno con conidias pequeñas y otro con grandes de M. anisopliae Corpoica M6, Corpoica M7 y de B. bassiana Corpoica B9 y Corpoica B10. El largo y ancho se midió con la ayuda del software Nikon Image Analyzer v. 2008 (tabla 1).

Tabla 1

Fuente: Elaboración propia

Los adultos de Compsus sp. recién emergidos se colectaron de trampas de emergencia tipo cono (Cardona 2010), instaladas en cada una de las fincas seleccionadas del municipio de Caicedonia (Las Brisas, El Recreo y Casa Brava) y trasladados al laboratorio. Antes de realizar su confinación en bandejas plásticas (20x20x20 cm), se realizó el proceso de confirmación taxonómica de la especie con el uso de la clave para la identificación de adultos descrita por O'Brien y Peña (2012).

Los adultos se alimentaron con hojas frescas de limón pajarito, C. aurantifolia (Christ.), previamente desinfectadas con una solución de hipoclorito al 3 % y para oviposición se le adicionaron tiras de 1 cm de ancho x 3 cm de largo de papel Parafilm^(r).

La cría se estableció en el laboratorio de insectos de la Universidad Nacional de Colombia, sede Palmira, con temperatura de 23 °C ± 5 y humedad relativa de 66% ± 7 a partir de posturas colectadas de los adultos confinados en laboratorio y previa identificación de la especie. Se revisó diariamente la presencia de posturas para su seguimiento y desarrollo en cámaras de emergencia consistentes en bandejas plásticas (20x20x20 cm), tapa con un área cubierta de muselina para permitir el intercambio de oxígeno y papel toalla para prevenir la acumulación de humedad y facilitar la limpieza de la unidad de cría.

Las larvas recién emergidas (figura 1a) se distribuyeron en vasos plásticos de 23 onzas con 10 g de arena estéril (120 °C durante 15 minutos) y trozos de zanahoria durante 70 días (figura 1b y c). El suministro de alimento se realizó cada tres días.

Figura 1

Se evaluó la patogenicidad de cuatro aislamientos nativos de B. bassiana y M. anisopliae, un testigo comercial de B. bassiana a una concentración estándar de 1x1010 esporas/ml. El tratamiento testigo fue agua destilada estéril (ADE). Los hongos se multiplicaron en arroz precocido y las conidias se cosecharon a los 25 días en una solución de Tween^(r) al 1 %. Las suspensiones se homogenizaron con vórtex durante cinco minutos.

La cuantificación de esporas se realizó con un hematocímetro mediante diluciones seriales hasta obtener la concentración óptima para conteo. La viabilidad de las conidias se determinó antes de cada ensayo, sembrando 0,1 ml de la concentración 1 x 10¹⁰ sobre placas de SDA e incubados a 27 ± 2 °C. La germinación se evaluó 12 horas después. El porcentaje de germinación se determinó del conteo de 100 esporas a una magnificación de 40x y tres repeticiones, de acuerdo a la metodología de Vélez et al. (1997).

Los insectos se desinfectaron en una solución de hipoclorito de sodio al 3% durante tres minutos y tres lavados sucesivos con ADE y su posterior secado se hizo en toallas de papel estéril. El tratamiento consistió en la inmersión de diez insectos en cada solución de hongo con una concentración de 1x1010 esporas/ml e individualizados en vasos plásticos (3x2x2 cm), con un disco de papel estéril y una rama con hojas de limón pajarito. El tratamiento control contó con el mismo número de insectos inoculados con ADE. El diseño experimental fue de bloques al azar y tres repeticiones en el tiempo.

La evaluación se realizó diariamente durante cinco días y se adicionó alimento nuevo cuando fue necesario. Se registraron individuos vivos o muertos con o sin signos de micosis, los cuales se individualizaron en cámaras húmedas en vasos plásticos con papel toalla estéril y humedecida con ADE hasta observar la esporulación del hongo para confirmar el agente causal de la muerte.

Los datos obtenidos se examinaron mediante un análisis de varianza y los promedios se compararon con la prueba de rango múltiple de Duncan (SAS Institute 2003).

Los nematodos entomopatógenos se reactivaron sobre larvas de último instar de D. saccharalis siguiendo la metodología de Kaya y Stock (1997); se almacenaron en nevera a una temperatura de 6-7 °C máximo ocho días antes de la inoculación.

Los aislamientos nativos de Steinernema sp. UNPS09, UNPS12 y UNP01 fueron obtenidos en trabajos previos de reconocimiento realizados por Caicedo et al. (2011) y Méndez, Riascos y Caicedo (2011), quienes identificaron el género con la clave de Kaya y Stock (1997).

Se realizó un primer ensayo para evaluar la patogenicidad sobre larvas de C. viridivittatus de 48 y 53 días de edad. La unidad experimental consistió de un vaso (23 oz) con 40 g de arena estéril, un trozo de zanahoria, una larva de C. viridivittatus (desinfectada previamente con hipoclorito de sodio al 3 %, durante 3 minutos y 3 lavados con ADE) y una concentración de nematodos, 1.000 IJS/ml de cada aislamiento. Los nematodos se aplicaron en el centro del sustrato. Al tratamiento testigo se le adicionó un ml de ADE.

Cada tratamiento contó con diez larvas por aislamiento y tres repeticiones en el tiempo, en un diseño de bloques al azar. Se evaluó el número de larvas vivas o muertas diariamente durante siete días. Los datos obtenidos se analizaron mediante un análisis de varianza y los promedios se compararon con la prueba de rango múltiple de Duncan (SAS Institute 2003).

Se seleccionó el aislamiento del género Steinernema sp. que causó el mayor porcentaje de mortalidad a las larvas de C. viridivittatus. El aislamiento UNS09 fue el seleccionado y se adicionó el nematodo nativo del género Heterorabditis sp. UNH16 sobre larvas de 53, 36 y 26 días.

La unidad experimental fue la misma del ensayo pero con dos concentraciones de nematodos, 500 y 4.000 IJS/ml de cada aislamiento; los nematodos se aplicaron en el centro del sustrato; y al tratamiento testigo se le adicionó un ml de ADE.

Cada tratamiento contó con diez larvas por aislamiento y tres repeticiones en el tiempo en un diseño de bloques al azar. Se evaluó el número de larvas vivas o muertas diariamente durante siete días con la concentración de 4.000 IJS/ml y nueve días con la concentración de 500 IJS/ml. Los datos obtenidos se analizaron mediante un análisis de varianza y los promedios se compararon con la prueba de rango múltiple de Duncan (SAS Institute 2003).

Se colectaron 132 muestras de suelo, de las cuales 120 resultaron positivas para hongos entomopatógenos. Se recuperaron 21 aislamientos, 13 de M. anisopliae y 8 de B. bassiana. Esta última se recuperó en mayor proporción de la finca Las Brisas con cinco aislamientos y tres de la finca El Recreo. M. anisopliae se recuperó principalmente de la finca Casa Brava (tabla 1).

La recuperación de NEP de las muestras de suelo fue negativa en todas las muestras procesadas. No fue posible obtener larvas de D. saccharallis con sintomatología de infección de NEP, en cambio, predominó la sintomatología por hongos entomopatógenos.

C. viridivittatus resultó susceptible a todos los aislamientos de hongos entomopatógenos evaluados ( figura 2a ) y no se observó diferencia significativa entre los aislamientos evaluados. El 100 % de mortalidad se presentó con las cepas Corpoica B9, Corpoica B10 (figura 2b) de las fincas El Recreo y Las Brisas y la cepa comercial de B. bassiana en un tiempo de 4 y 4,3 días, respectivamente. Las cepas Corpoica M6 y Corpoica M7 (figura 2c) de M. anisopliae de las fincas Casa Brava y Las Brisas causaron mortalidades de 94 % y 97 % a los 4,3 y 5 días, respectivamente.

Figura 2

Los tres aislamientos nativos de nematodos entomopatógenos del género Steinernema fueron capaces de causar mortalidad sobre larvas de C. viridivittatus (figura 3a). Este es el primer registro de evaluación de aislamientos nativos de nematodos entomopatógenos sobre larvas del picudo de los cítricos obtenidas en cría de laboratorio (figura 3b).

Figura 3

No se presentaron diferencias entre los aislamientos de Steinernema evaluados. El aislamiento UNS09 causó el 65% de mortalidad sobre larvas de 48 y 53 días de edad, 7 días después de inoculados. Los aislamientos UNS01 y UNS12 causaron 56% y 42,5% de mortalidad, respectivamente.

Los aislamientos de los dos géneros de NEP fueron capaces de causar mortalidad a las larvas de C. viridivittatus sin presentar diferencias (figura 4). Steinernema sp. UNS09 causó 85,7 % de mortalidad sobre larvas de 53 días (figura 5a), 81,9 % sobre larvas de 36 días (figura 5b) y 81,1 % de mortalidad sobre larvas de 26 días (figura 5c), respectivamente. Mientras que Heterorhabditis sp. UNH16 causó 81 %, 79 % y 75,4 % sobre larvas de 36 (figura 6a), 26 (figura 6b) y 56 días, respectivamente. En la figura 7 se observa la diferencia en coloración de las larvas de C. viridivittatus de diferentes edades de desarrollo (53, 36 y 26 días) causada por la infección de los nematodos entomopatógenos de los géneros Heterorhabditis y Steinernema.

Figura 4

Figura 5

Figura 6

Figura 7

Se destaca que las larvas de 53 días de edad se observaron como las más susceptibles a las dos especies de nematodos con 60,6 % de mortalidad (figura 8) siete días después de inoculados (figura 9).

Figura 8 Fuente: Elaboración propia

Figura 9 Fuente: Elaboración propia

Steinernema sp. UNS09 causó una mortalidad superior al 80 % sobre larvas de 53, 36 y 26 días, 9 días después de inoculadas. Los resultados contrastan con los obtenidos por otros autores sobre especies de curculiónidos, como Shapiro-Ilan (2001) quien evaluó la virulencia de 9 % especies de hongos entomopatógenos y 15 aislamientos de Steinernema y Heterorhabditis, en condiciones de laboratorio, sobre larvas del picudo de la nuez Curculio caryae y encontró una mortalidad variable entre 35,5 % y 55,3 %, posiblemente por la edad de las larvas y la pérdida de virulencia de los nematodos.

McCoy et al. (2000) mencionan que el producto comercial BioVector 355 compuesto de IJS de Steinernema feltiae, para el control de larvas de D. abbreviatus en cultivos de cítricos en La Florida, causó una mortalidad de 57,7 % en larvas de 35 y 60 días de edad con una concentración de 200 infectivos juveniles/ml, valor muy cercano al causado por el aislamiento UNPS100 del Tolima sobre larvas de C. viridivittatus, con 56 % de mortalidad.

Posteriormente, Stuart et al. (2004) evaluaron 12 aislamientos de nematodos y los compararon con BioVector 355 y una mezcla de este con todos los aislamientos. La mortalidad de las larvas estuvo entre 57,7 y 84,1 %, siendo el aislamiento comercial y su mezcla los que presentaron los porcentajes extremos. La baja mortalidad del producto comercial posiblemente se deba a la multiplicación sucesiva del nematodo en condiciones de laboratorio.

Resultados que contrastan con los obtenidos por Shapiro et al. (2004a), quienes evaluaron la eficacia de S. riobrave y S. feltiae para el control de las larvas de Conotrachelus nenuphar (Col.: Curculionidae) y un tratamiento químico con imidacloprid. De todos los tratamientos, S. riobrave fue el único que causó una reducción significativa en la emergencia del insecto del 97 %.

En concordancia con los trabajos realizados por diferentes autores con otras especies de coleópteros, es posible que existan especies o aislamientos de nematodos más patogénicos que los aquí evaluados, por tanto, se debe considerar la selección de los mejores aislamientos y la posibilidad de la combinación de hongos y nematodos entomopatógenos para la implementación de un programa de manejo integrado.

Las evaluaciones realizadas por Shapiro et al. (2004b), para determinar el efecto de la combinación de microorganismos para el control de larvas de Curculio caryae (Coleoptera: Curculionidae) con los nematodos H. indica y S. carpocapsae, los hongos B. bassiana, M. anisopliae, Paecilomyces fumosoroseus y la bacteria Serratia marcescens observaron antagonismo en todas las combinaciones de patógenos, con excepción de H. indica combinado con M. anisopliae, con la cual se obtuvo un efecto aditivo. Con esto se concluyó que, dependiendo de la tasa de aplicación, S. carpocapsae combinada con B. bassiana o S. marcescens presenta un efecto aditivo. Mientras que S. carpocapsae (aplicado solo) causó mayor mortalidad a las larvas de C. caryae comparado con otros patógenos aplicados solos.

Se considera que es importante realizar una evaluación con un mayor número de aislamientos nativos provenientes de diferentes ecosistemas e involucrar otros del género Heterorhabditis, lo cual podría contribuir al hallazgo de aislamientos con mayor potencial para el control de larvas de C. viridivittatus, como lo realizado por Shapiro y McCoy (2000), quienes evaluaron nueve especies de nematodos entomopatógenos y 15 aislamientos de Steinernema y Heterorhabditis sobre larvas de D. abbreviatus de octavo y noveno instar (un año de edad aprox.) y mostraron que la especie S. riobrave causó una mortalidad del 90 %, con una concentración de 500 infectivos/ml en un periodo de siete días.

Asimismo, es necesario evaluar la potencialidad de cada uno de los aislamientos en su condición ambiental original en rangos de temperatura entre 15 y 30 °C, teniendo en cuenta que las condiciones ambientales del bioensayo son contrastantes con la temperatura de origen de cada aislamiento, lo cual puede influir negativamente en la respuesta de la patogenicidad, como lo mencionan Grewal et al. (1994) y Shapiro et al. (1999), quienes, al evaluar aislamientos de H. bacteriophora (HP88 y Hbl), mostraron una reducción en la patogenicidad dentro de rangos de temperatura de 15 a 25 °C.

Glazer (1992) y Shapiro et al. (1999) afirman que existe un mayor grado de susceptibilidad al ataque por nematodos entomopatógenos en larvas jóvenes por su sistema inmune poco desarrollado, lo cual contrasta con los resultados obtenidos, siendo las larvas de 53 días de edad las más susceptibles al ataque por nematodos.

Se recomienda continuar con la evaluación de especies y aislamientos de hongos y nematodos entomopatógenos con un amplio rango de adaptabilidad tanto a temperatura como humedad para las aplicaciones en los diferentes agroecosistemas donde se distribuye el C. viridivittatus en el país. Es importante evaluar, además de la patogenicidad, las características como la capacidad de búsqueda, dispersión y persistencia, y la profundidad del suelo, las cuales son muy atractivas para el control de larvas de insectos-plaga que permanecen durante largos periodos en el suelo como las especies de curculiónidos (Schroeder y Beavers 1987).

Otros autores, como Mannion y Jansson (1992), Ricci et al. (1996) y Patterson y Lacey (1999), consideran que la evaluación de la patogenicidad en laboratorio de los nematodos entomopatógenos, es un factor relativo entre las especies de nematodos, por tanto, es muy importante completar su evaluación en condiciones de invernadero y campo.