Material Biológico: Se analizaron siete cepas de cianobacterias, aisladas de diferentes ambientes terrestres (Cuadro 1). La selección para su posterior caracterización morfológica y molecular se llevó acabo tomando en cuenta aquellos géneros en los que se presenta cierta ambigüedad taxonómica reportada para especies tropicales. Las cepas fueron cultivadas en medio líquido y agar BG₀-11, durante 15 días, esto con el fin de evaluar cualitativamente una actividad biológica específica correspondiente a la fijación de nitrógeno, lo que se visualiza como la capacidad de generar un aumento de biomasa. Las cepas se conservan en el Laboratorio de Biotecnología de Microalgas de la Escuela de Ciencias Biológicas, las cuales se repican mensual o bimensualmente en tubos de agar BG11 inclinado. Cada cultivo fue observado y fotografiado bajo un microscopio óptico Nikon eclipse Ni y las cianobacterias presentes se clasificaron a nivel de género adoptando el sistema propuesto por Desikachary (1959) y Komárek y Anagnostidis (1989, 1999, 2005).

Cuadro 1:

*Código de accesión en la Algoteca del Laboratorio de Biotecnología de Microalgas de la Universidad Nacional.

Extracción de ADN: El ADN genómico de las cepas de cianobacterias se aisló utilizando el protocolo de extracción por CTAB de Porebski, Bailey & Baum (1997), con ciertas modificaciones. Se tomó de 0,1-0,2g de biomasa, a la cual se adicionó 100µL de TE (10mM Tris, 1mM EDTA) y 3µL de proteinasa K (20mg/mL). Al contenido de cada tubo se le realizó una disrupción mecánica con balines de vidrio y metal, en un desmembrador Retsch mm400, a una agitación de 30Hz por 1min. El material homogenizado fue incubado a 37°C por una hora, seguidamente se adicionó 500µL de buffer CTAB 2X y se incubó a 65°C por 30min. Al lisado celular se le adicionó 500µL de Cloroformo-alcohol isoamílico (24:1) y se separaron las fases. La fase acuosa se recuperó y se agregó 0,5 volúmenes de NaCl 5M y 0,6 volúmenes de isopropanol para precipitar el ADN, seguido de una incubación a -20°C por una hora. El ADN recuperado se lavó con etanol 70%, se resuspendió en 100µL de agua libre de nucleasas (Ambion) y finalmente se realizó un tratamiento de eliminación de ARN mediante ARNasa Invitrogen (10µg/ mL), según las instrucciones de manufactura. El ADN obtenido se cuantificó con un NanoDrop 2000 UV-Vis Thermo Scientific, se movilizó en un gel de agarosa al 1% (TBE 1X), 80V por una hora y se visualizó en un transiluminador UV Fisher Scientific.

Amplificación por PCR de los genes 16S ARNr y rpoC1: Las reacciones PCR se realizaron en un volumen final de 20µL, el cual contenía buffer GoTaq Flexi 1X, MgCl₂ 2,5mM, dNTPs 0,2mM de cada uno, 1U de GoTaq Flexi ADN polimerasa y 150ng de ADN genómico aproximadamente. Además de 0,5mM de cada uno de los cebadores sentido y antisentido. Los cebadores empleados para amplificar la región de la subunidad pequeña del ARN ribosomal (16S ARNr) fueron los CYAN106F (5’-CGGACGGGTGAGTAACGCGTGA-3’) y CYAN781R (5’-GACTACWGGGGTATCTAATCCCWTT-3’), con un producto esperado de 805pb (Zhen et al., 2017). Para la reacción de amplificación de la región de la subunidad gamma de la ARN polimerasa dependiente de ADN (rpoC), se emplearon los cebadores rpoC145F (5’-ACTCTGAARCCAGAAATGGA-3’) y rpoC1006R (5’-TGCTTACCTTCAATAATGTC-3’) con un producto esperado de 880pb (Lee et al., 2014). Las amplificaciones se realizaron en un termociclador Proflex Applied Biosystems, con un perfil térmico de 95°C por 5min, 35 ciclos de 94°C por 1min, 60°C-55°C por 45s (16S ARNr y rpoC1, respectivamente), 72°C por 1min, y una extensión final de 72°C por 5min. Los productos derivados de la PCR se movilizaron en un gel de agarosa al 1,5% (TBE 1X) y se visualizaron en un transiluminador UV Fisher Scientific.

Secuenciación de los amplicones y análisis filogenético: Se utilizó un protocolo alternativo de limpieza y purificación de productos de PCR mediante precipitación con etanol 95% y acetato de sodio 3M (Cuevas, Goyenechea & Iturbe, 2007). Los productos de PCR purificados fueron secuenciados en ambas direcciones en un analizador genético multicapilar 3130, BigDye Terminator™ V3.1, Applied Biosystems, en el Laboratorio de Análisis Genómico (LAGEN) de la Escuela de Ciencias Biológicas de la UNA. Las secuencias obtenidas fueron editadas con el programa bioinformático Geneious R9, Biomatters Ltd, Nueva Zelanda y analizadas utilizando la herramienta básica de búsqueda local de similitud (BLASTn, por sus siglas en inglés) (Altschul, Gish, Miller, Myers & Lipman, 1990) de la base de datos NCBI (http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) mediante parámetros por defecto. Las secuencias obtenidas fueron depositadas en el GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank) con los siguientes números de accesión: MF581033 a MF581038.

Se realizó un análisis de posicionamiento filogenético entre las secuencias parciales de este estudio y las obtenidas en la base de datos Genbank. El árbol filogenético de las regiones 16S ARNr y rpoC1 se fabricaron derivados de un alineamiento con el programa en línea MAFFT 7.0 (http://mafft.cbrc.jp/alignment/server), con el método iterativo de refinamiento (FFT-NS-i) y el parámetro 1PAM / k = 2. Por otro lado, se utilizó el programa Gblocks (Castresana, 2002) para seleccionar bloques conservados (sin alineamientos erróneos, ni regiones divergentes) para el posterior análisis filogenético. Para determinar el mejor modelo de sustitución nucleotídica, el alineamiento se analizó con jModelTest 2.1.10 (Darriba, Taboada, Doallo & Posada, 2012) con la estrategia de selección mediante el criterio de información de Akaike (AIC). Posteriormente, se elaboró un árbol de posicionamiento filogenético utilizando el algoritmo de máxima vero similitud (ML) mediante el programa raxmlGUI v.7.4.2 (Stamatakis, Ludwig & Meier, 2005) con el modelo reversible en tiempo general (GTR-GAMMA), empleando 2 000 repeticiones. Los árboles fueron visualizados y editados con el programa FigTree 1.4 (Rambaut, 2009).

Basados en características fenotípicas, de las siete cepas estudiadas, se identificaron cuatro géneros de cianobacterias Nostocales: Calothrix sp. presenta heterocistos basales, tricoma estrechado hacia la parte terminal, células terminales piliformes, difícilmente observables en cultivos, vaina relativamente delgada, con evidencia de laminación, múltiples hormogonios presentes en los cultivos. Dimensiones: 5µ x 5.8µ (Fig. 1A, 1B). Tolypothrix sp con filamentos heteropolares, ramificaciones falsas en Y y T, heterocistos mayormente terminales con un solo poro. Las dimensiones que se observan son de células vegetativas 4,7µ x 5µ (Fig. 1C). Scytonema sp. presenta filamentos con ramificación falsa y enrollados, vaina gruesa y lamelada, necridios solitarios o agrupados-continuos (Fig. 1D). Nostoc sp. la cepa BGN04 presenta heterocistos principalmente terminales, algunos intercalares, los terminales se acortan levemente hacia los extremos, su reproducción implica la formación de hormogonios de morfología muy diferente, constreñidos en las paredes y muy móviles. Las dimensiones observadas son de acinetos 6,6µ x 4,7µ, heterocistos 4,2µ x 3,7µ y células vegetativas 2,7µ x 3,2µ (Fig. 1E). La cepa BGN25 se diferencia por la presencia de tricomas muy pequeños envueltos por una cubierta mucilaginosa muy fina (Fig. 1F).

Fig. 1

El análisis de posicionamiento filogenético entre las secuencias parciales de la subunidad pequeña del ARN ribosomal (16S ARNr) obtenidas y las derivadas del Genbank, evidencian un agrupamiento taxonómico que concuerda con la morfología observada en la Fig. 1. Por otro lado, el análisis de taxonomía molecular derivado de la región de la subunidad gamma de la ARN polimerasa dependiente de ADN (rpoC) mostró agrupamientos erráticos y poco soportados (dato no mostrado).

En la figura 2 se observan dos grandes clados que di viden la topología con soportes de las ramas de un 46% y 70%. El clado I que contiene a los géneros Scytonema y Calothrix; por otro lado el clado II que incluye a los géneros Anabaena, Nostoc, Tolypothrix y Trichormus. En el clado I (posicionado en el grupo superior de la topología), el aislado BGN23 está bien soportado junto con el agrupamiento de las especies del género Scytonema, específicamente a Scytonema geitleri. De igual manera las cepas BGN17, BGN18, BGN22 se asocian al nodo que derivan al género Calothrix sp., mostrándose una diferencia en el agrupamiento por especie entre BGN18 (asociado con Calothrix parietina, valor de soporte de la rama de un 89%) y BGN17-BGN22 (agrupadas con Calothrix brevissima, valor de soporte de la rama de un 87%).

Fig. 2

En el clado II (localizado en la agrupación de nodos inferiores a la topología), se observa que las cepas BGN04 y BGN25 se asocian al agrupamiento de Nostoc sp., sin embargo, los dos aislados se posicionan en la especie Nostoc entophytum. Por otro lado, el aislado BGN21 se localiza en el grupo de Tolypothrix sp., vinculado con la especie T. tenuis. Finalmente, de las agrupaciones que corresponde a Anabaena sp. y Trichormus sp. no se observaron asociaciones taxonómicas directas con las cepas de este estudio.

Las cepas identificadas mediante la observación de características morfológicas se localizan entre las cianobacterias pertenecientes al orden Nostocales (Komarek et al., 2014). Hasta el momento, existen algunos hallazgos científicos que tratan sobre la taxonomía y la filogenia de algunos géneros particulares pertenecientes al orden abordado en nuestro estudio, dichos estudios demuestran que la clasificación tradicional debe ser revisada (Rajaniemi et al. 2005). Sihvonen et al. (2007) sugieren que Tolypothrix y Calothrix corresponden a géneros polifiléticos, mientras que Lyra et al. (2001), Gugger et al. (2002), Iteman, Rippka, de Marsac y Herdman (2002) y Rajaniemi et al. (2005) lo hacen para los géneros Anabaena, Trichormus y Aphanizomenon, por ello el uso de herramientas moleculares es de suma importancia para esclarecer las relaciones entre los diferentes géneros, en especial aquellos provenientes de las zonas tropicales (Komarek, com. pers).

En combinación con el método morfológico, el método de taxonomía molecular basado en la región ribosomal 16S generó suficiente información para determinar que las cepas BGN corresponden taxonómicamente con lo descrito en la identificación fenotípica de este estudio. Existen amplios reportes sobre el empleo del gen 16S ribosomal como herramienta para desarrollar aproximaciones filogenéticas en cianobacterias (Wilmotte & Herdman, 2001; Svenning, Eriksson, & Rasmussen, 2005; Engene, Cameron & Gerwick, 2010; Bohunická et al., 2015). Estos estudios resaltan la importancia del uso de métodos moleculares asociados a aproximaciones fenotípicas para la correcta identificación taxonómica de las cianobacterias. Además, se propone el uso de genes alternativos de una sola copia como el rpoC1, región espaciadora intergénica de la ficocianina (cpcBA-IGS), genes de la nitrogenasa, entre otros (Seo & Yokota, 2003, Kumari, Srivastava & Bhargava, 2009; Lee et al., 2014). En nuestro estudio, el uso taxonómico de la región de la subunidad gamma de la ARN polimerasa dependiente de ADN (rpoC) no logró esclarecer la separación taxonómica de los cuatros géneros analizados, obteniéndose discrepancias de posicionamiento dentro de la topología construida, ya que las cepas se localizaron dentro un gran grupo del género Nostoc sp., debido a la carencia de secuencias de la región rpoC en el Genbank de los géneros en estudio, además de la posibilidad de amplificación preferencial de ADN contaminante dentro de la muestra (Lee et al., 2014).

Dentro de los géneros identificados, Calothrix sp. se ha utilizado en la estimulación de la producción de amonio y compuestos indólicos (Dhar, Prasanna, Pabbi & Vishwakarma, 2015). Estudios realizados en la determi nación de grupos microbianos en campos de leguminosas, se detectaron cepas de dicho género, lo que sugiere que este puede contribuir con la fertilidad de los suelos cultivados de este tipo, como producto de la fijación de nitrógeno (Avendaño, Pérez & Rodríguez, 2014).

Se han reportado especies del género Tolypothrix (T. tenuis) como una especie extensivamente usada como inóculo en los campos tropicales de arroz (Debnath & Bhadury, 2016). Particularmente en Argentina, esta ha sido utilizada en combinación con otros géneros para la producción de biofertilizantes secos adecuados para la aplicación aérea, aportando ventajas tanto al campo de la agricultura como el industrial (Silva & de Jesús, 2013).

Por otra parte, los géneros Nostoc y Tolypothrix, entre otros, se consideran recursos potenciales para la producción de biodiesel como combustible alternativo (Singh et al., 2017). Esto se debe a su capacidad productora de lípidos y a la rápida producción de biomasa, ya que en comparación con otras materias primas consideradas para producción de biodiesel como: aceites vegetales, grasa animal y desechos de aceite de cocina, estas presentan un suministro limitado, lo que impide la expansión de la producción del biocombustible (Prabakaran & Ravindran, 2011).

A partir de cianobacterias del género Scytonema se encontró el pigmento llamado scytonemina, el cual es de valor farmacológico (Bultel-Poncé, Felix-Theodose, Sarthou, Ponge & Bodo, 2004). El cual presenta, propiedades de protección contra la luz ultravioleta, además de anti-inflamatorias y anti-proliferativas en el caso de células T humanas con leucemia. Este pigmento se encuentra en varios géneros de cianobacterias, sin embargo, difieren en cantidad y rendimiento (Singh, Kumari, Rastogi, Sinha & Sinha, 2010).

En cuanto a Nostoc sp., la mayoría de las cianobacterias fotobiontes pertenecen a este género y se caracteriza por ser especies cosmopolitas, bien adaptadas a ambientes terrestres (Arima et al., 2012). En la industria alimenticia, este género juega un papel fisiológico y nutricional muy importante en la dieta humana por su alto contenido de fibra y proteína, y el mismo es consumido en países como Chile, México, Perú y Filipinas (Thajuddin & Subramanian, 2010).

Entre los géneros que han sido utilizados en agricultura reconocidos por su capacidad de mejorar la fertilidad del suelo con la fijación de nitrógeno y biorremediación, el género Nostoc, ha generado resultados prometedores como biofertilizantes útiles en campos experimentales de cultivo de arroz, incluso en zonas afectadas por inundaciones (Avendaño et al., 2014).

Diversos estudios han concluido que las cianobacterias, las cuales poseen potenciales de acondicionamiento de suelos y conservación del ambiente, podrían ser de los candidatos más apropiados en el desarrollo de prácticas sustentables en agricultura, y con ello la minimización de la dependencia de fertilizantes químicos (Kishore & Bimal, 2010).

Para efectos del monitoreo de aplicaciones biotecnológicas evitando bioensayos laboriosos, se ha implementado la identificación directa de genes relacionados a dichos potenciales. Un ejemplo de esto es la amplificación de genes que codifican para enzimas involucradas en procesos metabólicos; por ejemplo, la amplificación de la enzima nitrogenasa a partir de mRNA, la cual se ha realizado en estudios de asimilación de nitrógeno in situ con microorganismos (Mouser et al., 2009; Kumari et al., 2009).

En cuanto al aprovechamiento de cianobacterias como recurso biológico para prácticas en agricultura y otros, existe la necesidad de una rápida identificación y caracterización de taxones capaces de adaptarse a condiciones ambientales. Según nuestros hallazgos, es posible la identificación molecular exitosa de cepas de cianobacterias aisladas de ambientes tropicales mediante una secuencia parcial de la región ribosomal 16S, con el fin de continuar con el estudio de genes responsables de propiedades de interés biotecnológico para así evaluar su potencial hacia futuras aplicaciones y conservación de la biodiversidad.