Se realizaron muestreos durante los meses septiembre, octubre y noviembre de 2022, y en abril de 2023 de plantas de I. balsamina, I. hawkeri, C. roseus, y P. hortorum en dos unidades de producción localizadas en el Estado de Morelos. Se tomaron muestras de las hojas con síntomas típicos de virosis tales como manchas de color marrón o amarillo; deformación de las hojas; manchas necróticas en tallo; clorosis; mosaicos; manchas anulares de color púrpura oscuro en las hojas; y patrones de anillos; también se tomaron muestras de plantas que no presentaban síntomas de enfermedad (Figura 1). Las muestras fueron colocadas en toallitas de papel en bolsas de plástico y etiquetadas, se trasladaron al Laboratorio de Biotecnología Vegetal del Centro de Investigación en Dinámica Celular-Universidad Autónoma del Estado de Morelos (CIDCUAEM) donde se almacenaron a -20 °C hasta su análisis. De las mismas plantas muestreadas se capturaron trips con un aspirador entomológico, los cuales también fueron trasladados al laboratorio y conservados a la misma temperatura.

Figura 1

La extracción de ARN para plantas se llevó a cabo con diferentes métodos: para I. balsamina y P. hortorum se empleó el protocolo establecido por Michel-López et al. (2018) con algunas modificaciones: en un tubo de microcentrífuga se maceraron aproximadamente 100 mg de muestra congelada en nitrógeno líquido, se agregaron 700 µL de buffer de extracción (0.25 M NaCl, 20 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 4 % PVP (w/v), 1 % SDS (w/v)) y 700 µL de cloroformo:isoamílico (24:1), se mezcló en vórtex por 30 s, posteriormente se centrifugó 4 min a 12,800 rpm , se transfirió la fase acuosa a un nuevo tubo y se agregó 1 volumen de fenol:cloroformo:isoamílico (24:1:1), se centrifugó y transfirió la fase acuosa, se repitió la extracción, se agregó 10 % de acetato de sodio del volumen de la muestra y dos volúmenes de etanol al 100 %, se incubó 1 hora a -20 °C, se centrifugó 30 min, finalmente se realizaron tres lavados con etanol al 75 %, la pastilla fue diluida en agua y se incubó 10 min a 60 °C. La extracción de ARN de C. roseus fue con el reactivo Trizol, siguiendo las indicaciones del proveedor. Finalmente, para la obtención de ARN de I. hawkeri y C. persicum, se utilizó el kit de Monarch® Total RNA Miniprep Kit siguiendo las indicaciones del fabricante (NEB, 2023), y adicionando al buffer de lisis PVP al 4 %.

Para la extracción de ARN de los trips se siguió el protocolo de Boonham et al. (2002) aplicando algunas modificaciones: de 30-40 trips adultos se molieron en un tubo de microcentrífuga con 50 µL de buffer de extracción que contienía Tris-HCl 200 mM (pH 8.5), NaCl 250 mM, EDTA 25 mM, SDS al 0.5 % (p/v), se agregaron 450 µL más del mismo buffer, la precipitación se efectuó agregando 25 µL de acetato de sodio 3 M (pH 5.2). Los tubos se incubaron a -20 °C durante 90 min, posteriormente se centrifugaron durante 10 min. Se desechó el sobrenadante y se añadió 1 volumen de isopropanol (-20 °C). El contenido de los tubos se mezcló y se incubaron 30 min a -20 °C. Después se centrifugaron por 30 min, el sedimento se lavó con etanol al 70 % tres veces, se dejó secar a temperatura ambiente por 10 min y finalmente se resuspendió en 25 µL de agua.

La cuantificación de ARN se realizó en un espectrofotómetro DeNovix DS-11 FX a 260 nm. Para corroborar la integridad del ARN se realizaron geles de agarosa al 1 %, los cuales se corrieron por 45 min a 50 V.

La síntesis del cDNA se llevó a cabo en una reacción que contenía 2 μL de ARN, 2 μL de oligo dT (50 μM), 2 μL de buffer M-MuLV (10X), 1 μL de enzima M-MuLV (200 U/μL), 1 μL de dNTPs (10 mM), en un volumen de 20 μL; la mezcla se incubó a 42 °C por 60 min, posteriormente se inactivó la enzima a 65 °C por 20 min.

El cDNA obtenido de la reacción anterior se utilizó para la PCR, la cual contenía 2.5 µL del buffer de extracción, 0.65 µL de cada iniciador (10 µM), 2 µL de MgCl₂ (25 mM), 2.5 µL de dNTPs (0.2 mM), 0.5 µL de Taq polimerasa y 2 µL de cDNA. Las condiciones a las cuales se llevó a cabo la PCR tanto para detectar INSV en plantas como en trips fueron las siguientes: desnaturalización inicial en 94 °C durante 5 min; 35 ciclos a 94 °C durante 60 s, 60 s a 54 °C y 60 s a 72 °C; y una extensión final a 72 °C durante 10 min (Almasi y Almasi, 2018), las reacciones se llevaron a cabo en un sistema de detección CFX96™. Los productos de PCR se sometieron a una electroforesis en gel de agarosa al 2%.

Las reacciones de RT-LAMP se prepararon en un volumen de 12.5 μL que contenía 6.25 μL de WarmStart RT-LAMP 2X Master Mix, 0.25 μL del colorante fluorescente (50X), 1.25 μL de la mix de iniciadores para RT-LAMP (10X), 1 μL de cDNA, 3.75 μL de agua. Se incubaron a 65 °C por 240 ciclos de 15 s, aproximadamente 1 h en un sistema de detección CFX96™, para la lectura de la fluorescencia se utilizó el software CFX Manager™. Los iniciadores utilizados para la identificación de INSV se muestran en la Tabla 1 (Almasi y Almasi, 2018). Los productos obtenidos en esta reacción se observaron mediante un gel de agarosa, además se observó la fluorescencia de los tubos al exponerlos a luz ultravioleta.

Tabla 1

Iniciadores Secuencia

INSV_F TGATAAATAGCCAGAACTAG INSV_R ACTCAAAATGAAGGATCTTT INSV_FIP AATGGATCGGCTCTGACTGATTTTTTGAGGCAATCAAAGGGTGAC INSV_BIP ACCATTGCATCAAGTCTTCGTTTTTAGAAACAATTCAGAAAGAGT

Para establecer la sensibilidad en la detección de INSV mediante RT-PCR y RT-LAMP, se determinó la concentración de cDNAs individuales de las muestras positivas y posteriormente se realizaron diluciones seriadas 1:1. Las condiciones de las reacciones de RT-PCR y RT-LAMP fueron las mismas que anteriormente se describieron.

Se realizó la extracción individual de ARN de plantas, así como la síntesis de cDNA, para eficientar la detección de virus se realizaron pools de cDNAs de 10 plantas (5 juegos por especie) para llevar a cabo las PCRs. De los grupos de plantas que dieron resultados positivos, se procedió al análisis individual por PCR.

INSV fue detectado únicamente en plantas de I. hawkeri (Figura 2a), así como en los trips colectados en este cultivo (Figura 2b). También se detectó la presencia del INSV en trips colectados en plantas de C. persicum, aunque en este caso el virus no fue detectado en el tejido de la planta. El resultado fue negativo para todas las muestras de los cultivos de C. persicum, C. roseus, I. balsamina y P. hortorum, así como para los trips colectados en estas plantas, excepto los de C. persicum.

Figura 2

Con las muestras de plantas y de trips identificadas como positivas a INSV en RT-PCR, se procedió a estandarizar la reacción de RT-LAMP. En la Figura 3 se muestra la detección de INSV en cDNAs de plantas (1 y 3) así como en cDNAs de trips (2 y 4), el control negativo fue cDNA de planta sana (5). La Figura 3 muestra la detección precisa de las cuatro muestras positivas, tanto las de plantas como las de trips y cero detecciones en el control negativo. La amplificación comienza a partir de los 30 min de incubación hasta los 50 min, se presentan diferencias en los tiempos de detección en las muestras analizadas, lo cual probablemente se deba a las variaciones en las cargas virales presentes en cada una de las muestras.

Figura 3

Las muestras positivas en RT-LAMP se observaron con luz UV (Figura 4a), y los resultados se corroboraron con un gel de agarosa para observar los productos amplificados (Figura 4b). Una vez conociendo el tiempo adecuado de incubación, la reacción se puede llevar a cabo en un baño María y observar los resultados simplemente con luz UV, sin la necesidad del equipo para detectar fluorescencia.

Figura 4

Para establecer la sensibilidad en la detección de INSV mediante RT-PCR y RT-LAMP se realizaron diluciones seriadas 1:1 a partir del cDNA. En la Figura 5a se muestran los resultados de la detección de INSV por RT-PCR, en donde se observa claramente una banda hasta una concentración de 0.187 mg/ mL, por otro lado, mediante RT-LAMP se observó la detección del virus hasta una concentración 60 veces menor (0.003 mg/ mL) (Figura 5b). Estos resultados muestran que la sensibilidad de la técnica de RT-LAMP es mayor que la obtenida con RT-PCR.

Figura 5