El estudio se realizó en una casa de malla sombra (1610 PME-CR con 40 % de sombra), en el Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste, localizado al norte de la Ciudad de La Paz, Baja California Sur, a los 24^◦08’10.03” LN y 110^◦25’35.31” LO, a 7 metros de altura sobre el nivel del mar. El promedio de las temperaturas media, máxima y mínima en del sitio experimental fueron, 26.84±5.21, 44.17±4.92, 13.40±5.83 °C, respectivamente, con una humedad relativa de 52.8±14.95 %. Las condiciones temporales del clima en el área experimental se registraron con una estación climatológica portátil (Vantage Pro2^®, Davis, CA, USA).

Se utilizaron semillas certificadas provenientes de Seed Vis^® Company (Arcadia, CA, USA) de tres variedades de albahaca Nufar, Emily y Napoletano con respuesta diferencial al estrés por NaCl de acuerdo con Batista-Sánchez et al., 2015; Batista-Sánchez et al., 2017.

Se emplearon dosis de 0 y 0.5 mL L^-1 del bioestimulante FitoMas-E^®, procedente de la industria azucarera de Cuba. El FitoMas-E^® es un coctel natural de sales inorgánicas y otras sustancias de elevada energía, en la que se encuentran aminoácidos, polisacáridos biológicamente activos, lípidos, bases nitrogenadas, materia orgánica y nutrientes (Montano et al., 2007). Los niveles de salinidad en estudio fueron 0, 50, 100 y 150 mM de NaCl.

El diseño experimental fue completamente al azar con arreglo factorial (3A × 4B ×2C) para un total de 24 tratamientos con cuatro repeticiones por tratamiento, considerando como factor A, las variedades de albahaca con tres niveles (Nufar, Emily y Napoletano) el factor B, las concentraciones de NaCl con cuatro niveles (0, 50, 100 y 150 mM) y el factor C, las dosis de FitoMas-E^® con dos niveles (0 y 0.5 mL L^-1).

Las semillas de las tres variedades de albahaca se sembraron en charolas de poliestireno utilizando un sustrato comercial inerte (Sogemix VT-M^®, Premier Horticulture Inc., Canadá). Se logró la homogeneidad en la emergencia de las plántulas mediante riegos a saturación del sustrato cada 24 h, para lograr mantener la humedad de este. Cuando las plántulas tenían una altura promedio de 10 cm se realizó el trasplante, en canastillas hidropónicas de 150 mL que contenían un sustrato a base de vermiculita (Hortiperl, Termolita^® S.A de C.V, México) y un fragmento de fibra absorbente (Magitel^®, México) para garantizar la interacción del sistema radical con el medio de cultivo. Las canastillas con las plántulas (seis por cada contenedor) se colocaron en un sistema hidropónico de raíz flotante, el cual consistió en utilizar contenedores de poliuretano expandido de 69 × 38.5 × 25 cm, aforados a una capacidad 38 L con agua de 0.22 dS.m⁻¹ de conductividad eléctrica.

La solución nutritiva (SN) se utilizó de acuerdo con Samperio (1997) y se ajustó para albahaca a razón de 1 L de SN por cada 100 L de H₂O y estuvo compuesta por nitrato de potasio 160 g L^-1, nitrato de amonio 30.6 g L^-1, fosfato mono amónico 44.4 g L^-1, nitrato de calcio 180.6 g L^-1, sulfato de magnesio 126 g L^-1, sulfato ferroso 6 g L^-1, sulfato de manganeso 1.5 g L^-1, sulfato de zinc 0.3 g L^-1, sulfato de cobre 0.3 g L^-1, ácido bórico 0.3 g L^-1. Se le determinó el pH para comprobar que estuviera en nivel adecuado (6.5±0.4). Los tratamientos con FitoMas-E^® se aplicaron luego de un tiempo de adaptación de una semana posterior al trasplante, mediante la aspersión foliar a las plantas en el horario 8:00-9:00 am (cada siete días hasta finalizar el experimento a los 65 días), con dosis de 0.5 mL L⁻¹ y agua destilada como tratamiento control. Después del periodo de aclimatación de las plántulas, se aplicaron los tratamientos salinos (NaCl) en el medio de cultivo de forma progresiva, para evitar un shock osmótico (Murillo-Amador et al., 2007), empezando con 25 mM de NaCl hasta llegar a la concentración deseada (50, 100 y 150 mM). Para garantizar mantener las concentraciones salinas deseadas durante el periodo experimental, se realizaron mediciones directas al medio de cultivo con ayuda de medidores multiparámetros (Orion Star A322, LAQUAtwin), en los casos necesarios se realizaron las debidas correcciones.

El contenido de clorofila a (Chl a) y total (Chl total) se determinó a los 20, 40 y 60 días posterior al trasplante (DPT) utilizando una planta por repetición. Usado la tercera hoja a partir del punto de crecimiento se lavaron con agua desionizada para eliminar impurezas. La toma de muestra para la extracción de clorofila se realizó en hojas completamente expandidas, empleando 1g de tejido vegetal fresco, que posteriormente se trituró en acetona al 90 %. La absorbancia se midió con un espectrofotómetro con UV/Visible spectrophotometer (Pye Unicam SP6-550 UK) y las concentraciones de Chl se calcularon usando la ecuación de Strain y Svec (1966):

C h l   a   ( m g . m L - 1 )   =   11.64   x   ( A 663 )   -   2.16   x   ( A 645 ) (1)

C h l   b   ( m g . m L - 1 )   =   20.97   x   ( A 645 )   -   3.94   x   ( A 663 ) (2)

(A663) y (A645) representan los valores de la absorbancia leídos a 663 y 645 nm de longitud de onda, respectivamente.

La tasa fotosintética (TF) se determinó utilizando el medidor de fotosíntesis Li-Cor, modelo 6400XT (Li-cor^®, Lincoln, Nebraska, USA), en hojas totalmente expandidas, durante el horario de mayor intensidad luminosa (12:00 h). La TF se determinó a los 14, 21, 45 y 60 DPT.

Las variables independientes se sometieron al análisis de varianza y se consideraron diferentes significativamente cuando p ≤ 0.05. Las diferencias encontradas en los promedios de las variables independientes en cada factor de estudio, se compararon con la prueba de rango múltiple de Tukey HSD, a una p = 0.05. El programa para realizar los análisis estadísticos fue Statistica® v. 13.5.0.17 (TIBCO Software Inc. 2018).

El estudio interactivo variedades × NaCl × FitoMas-E^® (20 DPT), mostró diferencias significativas solo para Chl a y Chl total. También se encontró diferencia del contenido de clorofilas (Chl a y Chl total) entre las variedades, alcanzando mayores valores Napoletano>Nufar>Emily en 0 mM NaCl, con aplicación de FitoMas-E^®. Conforme las concentraciones de NaCl incrementaron, los pigmentos evaluados disminuyeron significativamente, mostrando los valores inferiores en el tratamiento de 150 mM NaCl sin el bioestimulante en todas las variedades. Este resultado puede ser generado por el estrés salino inducido, lo que provoca la destrucción de los cloroplastos por un aumento en la actividad de la enzima clorofilasa, lo que afecta la síntesis de clorofila (Ji et al., 2018). Se observó que las plantas que recibieron 150 mM NaCl con aplicación de FitoMas-E^® incrementaron los valores de Chl a y Chl total con respecto a las plantas que fueron tratadas con 150 mM NaCl sin aplicar el bioestimulante (Tabla 1). Estos hallazgos se pueden explicar por la presencia de aminoácidos contenidos en el bioestimulante como es el ácido glutámico (Glu), que en conjunto con glicina (Gly), arginina (Arg) y alanina (Ala) intervienen en la síntesis de clorofila, en la actividad fotosintética y aumentan la cantidad de clorofila en las hojas, además actúan en la protección de las plantas frente a diferentes estreses abióticos (D’Mello, 2015; Batista-Sánchez et al., 2019).

Tabla 1

Variedades	NaCl (mM)	FitoMas-E® (mL.L-1)	Clorofila
			20 DPT		40 DPT		60 DPT
			Clorofila a (μg.cm-2)	Clorofila total (μg.cm-2)	Clorofila a (μg.cm-2)	Clorofila total (μg.cm-2)	Clorofila a (μg.cm-2)	Clorofila total (μg.cm-2)
Napoletano	0	0	30.36 abcd*	39.24 abc	30.55 ab	39.80 ab	23.88 abc	30.64 abc
		0.5	32.38 a	41.91 a	32.38 a	43.24 a	26.29 a	34.44 a
	50	0	27.07 ghij	34.51 efghijk	27.06 cdefgh	35.70 defgh	21.96 bcdef	28.49 bcde
		0.5	29.60 bcde	38.31 bcd	30.54 ab	39.42 bc	24.46 ab	32.07 ab
	100	0	27.21 fghij	36.04 cdefghi	27.21 cdefg	35.68 defgh	22.33 bcdef	29.00 bcde
		0.5	28.35 cdefgh	36.06 cdefgh	28.35 bcdef	36.04 cdefg	22.50 bcdef	29.06 bcde
	150	0	24.03 lm	30.66 lm	23.03 i	29.66 k	20.28 efg	26.36 defg
		0.5	25.96 ijkl	33.44 ghijkl	26.47 defgh	34.13 efghij	20.31 efg	26.62 cdefg
Nufar	0	0	29.86 bcd	39.44 abc	29.86 abc	39.00 bcd	22.61 bcdef	29.50 bcde
		0.5	31.82 ab	40.30 ab	30.49 ab	39.44 bc	24.56 ab	31.87 ab
	50	0	27.39 efghij	35.30 defghi	27.06 cdefgh	34.88 efghi	19.50 fgh	25.38 efgh
		0.5	28.96 cdefg	36.86 bcdefg	28.71 bcde	37.44 bcde	22.45 bcdef	29.13 bcde
	100	0	25.38 jkl	32.59 ijkml	25.38 fghi	32.59 ghijk	18.50 gh	24.29 fgh
		0.5	26.04 hijkl	33.82 fghijkl	26.63 defgh	34.69 efghij	21.82 bcdef	28.15 bcdef
	150	0	22.76 m	29.20 m	22.76 i	29.20 k	17.00 hi	22.63 ghi
		0.5	24.50 klm	31.76 jklm	24.37 ghi	32.19 hijk	18.45 gh	24.33 fgh
Emily	0	0	29.52 bcdef	37.81 bcde	29.45 abcd	37.61 bcde	22.95 bcde	29.51 bcd
		0.5	30.62 abc	39.56 ab	30.88 ab	39.40 bc	23.74 abcd	30.52 abc
	50	0	26.78 ghijk	35.08 defghij	25.93 efghi	33.34 fghij	18.61 gh	24.27 fgh
		0.5	28.20 defghi	37.02 bcdef	28.45 bcdef	36.45 bcdef	21.08 cdefg	27.43 cdef
	100	0	23.94 lm	31.12 klm	23.94 hi	31.12 jk	16.43 hi	21.87 hi
		0.5	25.52 jkl	33.21 hijkl	24.93 ghi	32.34 hijk	20.63 defg	27.31 cdef
	150	0	19.74 n	24.94 n	17.74 j	22.94 l	0.00 j	0.00 j
		0.5	24.02 lm	31.71 jklm	24.15 ghi	31.29 ijk	13.88 i	18.52 i

*Los valores promedio con letras distintas en una misma columna difieren estadísticamente (Tukey HSD, p = 0.05). DPT: días posteriores al trasplante.

A los 40 DPT, el estudio interactivo variedades × NaCl × FitoMas-E^®, mostró diferencias significativas solo para Chl a y Chl total. La respuesta a los 40 DPT fue similar que la mostrada en el análisis de los 20 DPT, el contenido de Chl a y Chl total fue más alto en Napoletano>Nufar>Emily al recibir el tratamiento con el bioestimulante y 0 mM NaCl. Este resultado puede estar determinado por el contenido de nutrientes de fácil absorción que contiene el bioestimulante, lo que facilita mayor eficiencia en los procesos metabólicos de las plantas tratadas (Calero-Hurtado et al., 2022). A los 40 DPT la Chl a y Chl total disminuyeron conforme las concentraciones de NaCl incrementaron, mostrando menores valores cuando las plantas de las tres variedades se encontraban sometidas a 150 mM NaCl sin FitoMas-E^®. La variedad Emily presentó los valores promedio inferiores de clorofilas en todos los tratamientos (Tabla 1). Esta respuesta se puede explicar por las características de dicha variedad, catalogada como sensible a la presencia de NaCl en el medio de cultivo (Batista-Sánchez et al., 2015; Mazón-Suástegui et al., 2018).

A los 60 DPT, el análisis interactivo variedades × NaCl × FitoMas-E^® mostró diferencias significativas para Chl a y Chl total. La respuesta de los pigmentos fue similar a las evaluaciones realizadas con anterioridad (20 y 40 DPT) la concentración de Chl a y Chl total en las diferentes variedades se describe en orden descendente Napoletano>Nufar>Emily en 0 mM NaCl con aplicación de FitoMas-E^®. La concentración de pigmentos disminuyó desde un 7 % en Napoletano con 50 mM de NaCl y 0 FitoMas-E^® hasta un 100 % en la variedad Emily con 150 mM de NaCl y 0 FitoMas-E^® con respecto al tratamiento control. Con la aplicación de FitoMas-E^® la Chl a y Chl total se incrementaron en las tres variedades de albahaca (Tabla 1). Los resultados encontrados para la concentración de pigmentos evaluados al aplicar el bioestimulante están relacionados con la presencia de nitrógeno en el FitoMas-E^®, macronutriente que interviene directamente en la producción de clorofilas (Pulido et al., 2013).

De forma general los estudios entre la relación del estrés por salinidad y la concentración de pigmentos en plantas, muestran que este efecto se atribuye a la afectación de los cloroplastos y al incremento del movimiento enzimático de la clorofilasa, perturbando la formación de clorofilas (Chávez et al., 2015). La acumulación de pigmentos disminuyó de manera significativa en los tratamientos donde se aplicó NaCl sin el bioestimulante, con un efecto negativo más notable en el contenido de pigmentos de la variedad Emily que se caracteriza como sensible al estrés por NaCl (Batista-Sánchez et al., 2019). La acumulación de pigmentos se incrementó en las plantas donde se aplicó el FitoMas-E^® ya que su uso se favorece la formación de tejidos vegetales y síntesis de clorofilas, que es el pigmento encargado de captar la energía lumínica para que sea transformada en energía química, por lo tanto, una mayor cantidad de clorofilas desencadena una mayor captación de energía y por lo tanto un aumento de la tasa fotosintética (Castillo-Portela et al., 2011; Reyes et al., 2017). Estos resultados muestran la acción mitigadora del FitoMas-E^® ante situaciones de estrés provocado por NaCl, con el aumento de la síntesis de sustancias capaces de mitigar el efecto provocado por este estrés abiótico. Los resultados son similares a los reportados por Reyes et al. (2017) en arroz, observando un incremento en los pigmentos fotosintéticos en plantas estresadas por NaCl y tratadas foliarmente con 24-epibrasinólida. Los resultados con el uso de bioestimulantes como mitigadores del estrés por NaCl, coinciden en que las plantas tratadas alcanzan promedios significativamente superiores en la concentración de pigmentos fotosintéticos, lo cual se atribuye a la posible activación de mecanismos de defensa y/o presencia de mayor disponibilidad de nutrimentos en las plantas, lo que repercute de forma positiva en los procesos fisiológicos facilitando mitigar los efectos de la salinidad por NaCl (Batista-Sánchez et al., 2022; Hannachi et al., 2022).

La tasa fotosintética (TF) mostró diferencias significativas a los 14, 21, 45 y 60 DPT entre variedades, NaCl y FitoMas-E^®. El diferencial entre variedades se observó a los 14, 21, 45 y 60 DPT, con valores superiores en orden descendente Napoletano > Nufar > Emily en 0 mM NaCl con aplicación de FitoMas-E^® para TF (Tabla 2). Estos resultados se deben a las características morfo fisiológicas de las variedades estudiadas, siendo Napoletano una variedad de hojas anchas y extendidas lo que facilita la absorción de mayor energía luminosa, seguida por la variedad Nufar y posteriormente Emily, esta última con hojas más estrechas y alargadas (Batista-Sánchez et al., 2019).

Tabla 2

Variedades	NaCl (mM)	FitoMas-E® (mL L-1)	Tasa fotosintética (µmol m-2 s-1)
			14 DPT	21 DPT	45 DPT	60 DPT
Napoletano	0	0	19.91bcde	20.09bc	19.24bc	18.07bcd
		0.5	23.32a	24.53a	21.99a	22.84a
	50	0	18.11cdef	17.47def	17.40cdef	16.82def
		0.5	20.90abc	20.53b	20.19ab	19.70bc
	100	0	17.92def	15.32ghi	16.31efg	13.08gh
		0.5	20.56abcd	17.76de	17.82cde	15.28efg
	150	0	9.15ijk	12.71jk	12.38ijk	8.85lmn
		0.5	16.23fg	15.65fgh	14.63ghi	12.28hij
Nufar	0	0	19.26bcde	18.59cd	18.74bcd	17.60cde
		0.5	21.49ab	20.24bc	20.34ab	20.02b
	50	0	17.38ef	16.67efg	15.24fgh	11.86hijk
		0.5	20.34bcd	18.94bcd	18.39bcde	15.30efg
	100	0	8.63jkl	14.51hij	14.24ghij	9.97jklm
		0.5	19.73bcde	15.66fgh	16.40defg	12.43hi
	150	0	5.89lm	11.32k	8.97l	7.55mn
		0.5	10.99ij	14.38hij	13.18hijk	10.40ijkl
Emily	0	0	19.25bcde	17.57de	18.39bcde	14.97fg
		0.5	20.96ab	19.95bc	19.31bc	18.72bcd
	50	0	17.22ef	15.13ghi	13.49hijk	9.49klm
		0.5	20.59abcd	17.42def	17.41cdef	12.94gh
	100	0	6.42klm	13.48ij	11.38k	6.93n
		0.5	14.08gh	14.30hij	14.12ghij	10.95hijkl
	150	0	3.77m	8.99l	5.86m	0.00o
		0.5	11.61hi	12.95jk	12.15jk	2.71ñ

DPT: días posterior al trasplante. Los promedios con letras distintas en una misma columna difieren estadísticamente (Tukey HSD, p = 0.05).

La respuesta de la tasa fotosintética a través del tiempo mostró una tendencia a disminuir conforme los niveles de NaCl incrementaron, con valores inferiores en todas las variedades con 150 mM NaCl sin el bioestimulante y conservando el orden Napoletano>Nufar>Emily. Se encontró un aumento de la TF en las tres variedades con 150 mM NaCl y 0.5 mL L^-1 FitoMas-E^® con respecto a 150 mM sin el bioestimulante. Como se mencionó anteriormente, a los 60 DPT, las plantas de Emily no toleraron el tratamiento de 150 mM y 0 FitoMas-E^®, presentaron muerte de tejidos y no fue posible evaluar la tasa fotosintética; sin embargo, las plantas de la misma variedad en 150 mM con FitoMas-E^®, presentaron tolerancia al NaCl aunque la tasa fotosintética fue menor respecto a la Napoletano y Nufar (Tabla 2).

En la fotosíntesis, de igual manera que en otros procesos metabólicos, intervienen diversos factores y su aumento está determinado por un incremento de CO₂ en las células especializadas, mediante el intercambio de gases que tiene lugar al ejecutarse la apertura y cierre estomático (Reyes et al., 2017). En esta investigación, la TF disminuyó significativamente en las plantas expuestas a estrés por NaCl y sin aplicar el FitoMas-E^®, con una disminución de la TF de 47.9 % en la variedad Napoletano transcurridos 60 DPT, 59 % en Nufar a los 14 DPT y 92 % en Emily a los 60 DPT. Estos resultados son evidencias del efecto directo que provoca el estrés por NaCl al reducir la acumulación de CO₂ en las células especializadas por efecto del cierre estomático (Ji et al., 2018). Por su parte, Percey et al. (2016) proponen que la reducción en la fotosíntesis se debe a una inhibición en el metabolismo debido a la alteración de los mecanismos antioxidantes de las plantas. La TF de las variedades en estudio, se incrementó al aplicar de manera foliar 0.5 mL L^-1 de FitoMas-E^®. Esta respuesta es una evidencia de la acción benéfica del FitoMas-E^® en las plantas mitigando el efecto directo del estrés por NaCl en la tasa fotosintética ya que está compuesto por aminoácidos precursores de la prolina, que está catalogada como un antioxidante que responde a los eventos de estrés, funciona como un osmolito en la permeabilidad de la membrana de la raíz, estabiliza las proteínas e inhibe peroxidación lipídica (Berbara y García, 2014; Batista-Sánchez et al., 2022). La acumulación de prolina generalmente se correlaciona con una tolerancia mayor al estrés y se ha demostrado que la aplicación exógena de compuestos de aminoácidos mejora la tolerancia a estrés biótico y abiótico en plantas superiores (Ahmad et al., 2016). Estos hallazgos positivos también pueden estar relacionado con el Glu existente en el bioestimulante es un aminoácido que se encuentra en las células oclusivas de los estomas y actúa como un agente osmótico para el citoplasma de las células, al proteger la integridad de la membrana celular y reducir permeabilidad para que no se rompa fácilmente y favorezca la apertura de los estomas (Berbara y García, 2014). Además, este bioestimulante tiene un efecto directo en el incremento del área foliar, permitiendo una TF mayor (Calero-Hurtado et al., 2022). Un estudio anterior reportado por Batista-Sánchez et al. (2019) mostró que, el FitoMas-E^® con dosis de 0.5 ml L^-1 incrementó el contenido de K⁺, favoreciendo directamente al mecanismo de apertura y cierre estomático y de esta manera mitigó el efecto negativo del NaCl en concentraciones de 50, 100 y 150 mM de NaCl.