Los genomas bacterianos pertenecientes a cepas de L. delbrueckii subsp. bulgaricus y L. delbrueckii subsp. lactis se recuperaron de la base de datos pública GenBank en formato FASTA y GFF. Los genomas seleccionados estaban completamente secuenciados a la fecha de junio del 2021.

Para seleccionar genes que participan en la formación de biopelículas, se realizó una revisión exhaustiva de la literatura donde se caracterizaron genes y/o proteínas involucradas en las etapas de formación de biopelículas del género Lactobacillus. Una vez identificados los genes, se hizo la búsqueda de las secuencias codificantes en la base de datos pública GenBank y las secuencias se recuperaron en formato FASTA.

Una vez seleccionados los genes a estudiar, se buscaron en los genomas bacterianos de las cepas de L. delbrueckii subsp. bulgaricus y L. delbrueckii subsp. lactis utilizando las herramientas bioinformáticas BLASTN y BLASTP. Las secuencias nucleotídicas y/o peptídicas identificadas de los genomas bacterianos se sometieron a un análisis de identidad mediante un alineamiento local de secuencias nucleotídicas y/o peptídicas empleando los servidores BLASTN y BLASTP, con el objetivo de determinar el grado de conservación entre ambas subespecies (Altschup et al., 1990). De los genes seleccionados se obtuvieron las secuencias peptídicas para analizar regiones o dominios proteicos de relevancia mediante los servidores UniProtKB de Expasy e Interpro.

Con la finalidad de identificar si los genes seleccionados se encuentran en unidades transcripcionales monocistrónicas o policistrónicas se empleó el programa Operon-mapper, el cual analiza la distancia intergénica de genes vecinos y las relaciones funcionales de sus productos codificantes (Taboada et al., 2018). Por otro lado, el análisis del contexto genómico se realizó por medio del software Artemis (Rutherford et al., 2000). Subsecuentemente se utilizó el programa VISTA para la detección de diferencias en la presencia y orden de los genes que forman parte de las unidades transcripcionales (Frazer et al., 2004).

La identificación de potenciales factores de transcripción involucrados en la formación de las biopelículas, se realizó́ en dos etapas sucesivas: una búsqueda de reguladores transcripcionales descritos en la base de datos del NCBI tomando a Bacillus subtilis como microorganismo modelo, posteriormente, dichas secuencias fueron identificadas en los genomas de estudio pertenecientes a L. delbrueckii subsp. bulgaricus y L. delbrueckii subsp. lactis.

A continuación se recuperó la secuencia corriente arriba (400 pb) de los genes seleccionados utilizando el servidor RSAT: Prokaryotes (http://embnet.ccg.unam.mx/rsat/index.php) (Santana-Garcia et al., 2022). Con los programas Oligo-analysis y dyad-analysis (Defrance et al., 2008), se determinó si la secuencia corriente arriba identificada presenta motivos de unión a potenciales factores de transcripción en la formación de las biopelículas.

El análisis de los genomas de referencia reportados en la base de datos Genbank mostró la anotación de 104 secuencias genómicas pertenecientes a 6 subespecies de L. delbrueckii, de las cuales sólo 27 genomas se encontraron secuenciados completamente. Las secuencias genómicas pertenecen a las cepas de L. delbrueckii subsp. bulgaricus (11.5 %), L. delbrueckii subsp. lactis (6.7 %) y cepas de otras subespecies (7.6 %). Siendo los genomas de L. delbrueckii subsp. bulgaricus y de L. delbrueckii subsp. lactis los más representados de las cepas de L. delbrueckii.

Se recuperaron las secuencias genómicas completas en formato FASTA de L. delbrueckii subsp. bulgaricus (12 genomas) y de L. delbrueckii subsp. lactis (7 genomas) y se analizaron los datos reportados en la base de datos, de donde se observa que el tamaño del genoma de las cepas de L. delbrueckii subsp. bulgaricus es de aproximadamente 1.8 Mb, mientras que los genomas de L. delbrueckii subsp. lactis, se encuentran en un rango de 2.0 a 2.3 Mb. Ambas subespecies cuentan con un porcentaje de GC inferior al 50 % y un promedio de secuencias codificantes (CDS) de 1615. No obstante, cerca del 40 % de CDS presentan una función desconocida (Tabla 1).

Tabla 1

Organismo	Cepa	Acceso GenBank	Tamaño (Mb)	%GC	CDS
L. delbrueckii subsp. bulgaricus	LJJ	CP049052.1	1.89109	49.5	1620
	KLDS1.1011	CP041280.1	1.88749	49.8	1629
	MN-BM-F01	CP013610.1	1.87507	49.7	1598
	KLDS1.0207	CP032451.1	1.86918	49.8	1625
	DSM 20080	CP019120.1	1.86818	49.8	1585
	ND04	CP016393.1	1.86175	49.6	1544
	ACA-DC 87	LT899687.1	1.856	49.8	1585
	L99	CP017235.1	1.84811	49.7	1580
	ATCC 11842	CR954253.1	1.865	49.7	1572
	2038	CP000156.1	1.87292	49.7	1584
	ND02	CP002342.1	2.13198	49.59	1855
	ATCC BAA-365	CP000412.1	1.85695	49.7	1595
L. delbrueckii subsp. lactis	KCCM 34717	CP018215.1	2.26338	49.1	1958
	DSM 20072	CP022988.1	2.16598	49	1796
	KCTC 3034	CP023139.1	2.23761	49	1881
	Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis 1	LS991409.1	2.05032	49.6	1680
	KCTC 3035	CP018156.1	1.97273	50	1695
	NWC_1_2	CP029251.1	2.25977	48.5793	1909
	MAG_rmk202_ldel	CP046131.1	2.18449	48.9603	1801

Como primer paso para la elección de genes involucrados en la formación de biopelículas se hizo una revisión bibliográfica exhaustiva donde se analizaron genes y/o proteínas que participan en las etapas de formación de biopelículas de bacterias ácido-lácticas. De este análisis minucioso se seleccionaron diez genes bastante bien caracterizados, los genes: pili, welE, luxS, msa, ccpA, gadph, srtA, inu, bfrK y epsD (Leeber et al., 2012; Malik et al., 2013; Walter et al., 2008; Hao et al., 2011). Estos genes fueron buscados en los genomas de las cepas de L. delbrueckii subsp. bulgaricus y de L. delbrueckii subsp. lactis. Los resultados muestran que existen genes asociados al metabolismo de carbohidratos con mayor frecuencia en L. delbrueckii subsp. bulgaricus, mientras que genes asociados a la adhesión a superficie se identificaron de forma relevante en L. delbrueckii subsp. lactis (Figura 1). De los diez genes analizados, se seleccionaron 4 genes con evidencia experimental asociada a diferentes etapas de la formación de biopelículas en bacterias del género Lactobacillus; pili (pilina) y srtA (sortasa de clase A), son genes que codifican a enzimas involucradas en las etapas de adhesión primaria y secundaria; y los genes inu y epsD, los cuales participan en la etapa de maduración de las biopelículas produciendo homo y heteropolisacáridos (Tabla 2).

Figura 1

Tabla 2

Gen	Función	Organismo	Referencia
pili	Pilina, involucrada en la adhesión y agregación bacteriana	Lactobacillus rhamnosus	Leeber et al., 2012
srtA	Sortasa de clase A, responsable de anclar covalentemente las proteínas de superficie a la pared celular	Lactobacillus plantarum	Malik et al., 2013
inu	Inulosacarasa, implicada en la producción de glucanas y fructanas (síntesis de homopolisacáridos)	Lactobacillus reuteri	Walter et al., 2008
epsD	Proteína de síntesis de heteropolisacáridos	Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	Hao et al., 2011

La caracterización de los genes asociados a la formación de biopelículas se realizó a parir de los archivos en formato GFF. La búsqueda inicial del gen pili en los genomas de L. delbrueckii subsp. lactis y L. delbrueckii subsp. bulgaricus indicó que corresponde a una secuencia anotada como Prepilin-type N-terminal con una extensión de 324 nucleótidos. El alineamiento local de la secuencia de nucleótidos mostró que el gen de Prepilin-type N-terminal se encuentra presente en el 100 % de los genomas de estudio, L. delbrueckii subsp. bulgaricus (12) y L. delbrueckii subsp. lactis (7). Se identificó un porcentaje de identidad global en un rango del 97.2 % al 98.77 % para L. delbrueckii subsp. bulgaricus y del 98.46 % al 100 % para L. delbrueckii subsp. lactis (Tabla 3). Con respecto al gen srtA presenta una extensión de aproximadamente 702 nucleótidos y una localización muy variable según entre las subespecies y las diferentes cepas, está presente en el 100 % de los genomas de L. delbrueckii subsp. bulgaricus (12) y L. delbrueckii subsp. lactis (7), y el alineamiento nucleotídico reveló un rango de identidad del 98.15 % al 99.98 % para L. delbrueckii subsp. bulgaricus y de entre 99.15 % y 100 % para L. delbrueckii subsp. lactis. (Tabla 3).

La etapa de maduración de las biopelículas consta de la síntesis de exopolisacáridos, que se pueden clasificar en homopolisacáridos y heteropolisacáridos. El gen epsD participa en la síntesis de heteropolisacáridos durante la formación de la biopelícula, la secuencia genética de aproximadamente 777 pb fue determinada en el 100 % (12/12) de los genomas de L. delbrueckii subsp. bulgaricus, con un porcentaje de identidad superior de 96.78 %. Por otro lado, dicha secuencia fue identificada en el 71.4 % (5/7) de los genomas de la subespecie L. delbrueckii subsp. lactis. No se obtuvieron resultados positivos para las cepas KCCM 34717 y KCTC 3034 (Tabla 3).

Tabla 3

Organismo	Cepa	% Identidad
		pili1	srtA1	epsD2
L. delbrueckii subsp. bulgaricus	ATCC 11842 = JCM 1002	97.22	99.00	96.01
	ND02	98.77	99.29	94.85
	LJJ	96.91	98.86	96.78
	KLDS1.1011	97.22	99.00	94.85
	MN-BM-F01	97.22	98.15	94.85
	2038	97.84	98.58	100
	KLDS1.0207	97.53	98.86	94.85
	DSM 20080	97.53	98.86	94.85
	ND04	97.22	98.43	98.58
	ATCC BAA-365	97.84	98.72	96.40
	ACA-DC 87	97.84	98.43	95.24
	L99	97.84	99.15	95.88
L. delbrueckii subsp. lactis	DSM 20072	100	99.57	94.72
	KCTC 3034	100	100	N.D.
	Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis1	100	99.43	94.98
	KCTC 3035	100	99.15	95.75
	NWC_1_2	100	99.57	93.83
	MAG_rmk202_ldel	100	99.72	93.83

Partiendo de la secuencia codificante de la inulosacarasa (inu) de Lactobacillus reuteri TMW1.106 se realizó un análisis de identidad para identificar proteínas homólogas en los genomas de estudio, teniendo como resultado la detección de cuatro proteínas: dos glicosil hidrolasas de la familia 68, una levansacarasa y una proteína hipotética LDE04_11610 con porcentajes de identidad del 43.83, 43.48, 43.83 y 45.15 % respectivamente (Tabla 4).

Tabla 4

Microorganismo	Nombre	Cobertura	E-Value	% Id	Acceso
Lactobacillus delbrueckii	Glucósido hidrolasa de la familia 68	63 %	3.00E-142	43.83	WP_035182812.1
Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis DSM 20072	Levansacarasa	63 %	4.00E-142	43.83	EGD27493.1
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	Glucósido hidrolasa de la familia 68	63 %	7.00E-141	43.48	WP_003614406.1
Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis	Proteína hipotética LDE04_11610	59 %	2.00E-139	45.15	EGD27493.1

El análisis de familias y dominios proteicos realizado en Interpro mostró que la secuencia de aminoácidos del Prepilin-type N-terminal pertenece a la familia de la proteína de competencia “ComGC”, la cual representa una pseudopilina, a su vez conserva diferentes elementos, como el sitio de metilación procariota N-terminal, el dominio de escisión N- terminal y el motivo de metilación procariota N-terminal. El alineamiento de la secuencia peptídica determinó un porcentaje de identidad superior al 98.14 %. Las cepas de L. delbrueckii subsp. bulgaricus LJJ y ND04 presentaban hasta tres variaciones de nucleótidos, mientras que el resto únicamente presentaban dos modificaciones. Se analizó tambien si existían cambios puntales de aminoácidos entre las secuencias peptídicas. Las modificaciones de aminoácidos detectadas se encuentran en sitios de unión entre dominios. El residuo nueve es quien presenta cambios más frecuentes, cambiando una glutamina (Q) por una prolina (P); pero también se encontraron cambios en la posición 21 entre una valina (V) y una leucina (L).

Por su parte, la proteína sortasa de clase A, pertenece a la familia sortasa, se caracteriza por anclar un gran número de proteínas de superficie funcionalmente distintas que contienen una señal de clasificación de pared celular bacteriana. La secuencia peptídica muestra un porcentaje de identidad superior del 99.57 %. Adicionalmente, se identificaron cambios de aminoácidos entre ambas subespecies, los cuales se presentan en los sitios de unión entre dominios. Los cambios observados en esta secuencia de aminoácidos no se presentan en el sitio activo ni en el sitio catalítico, se dan en sitios de unión entre dominios. Los cambios más significativos son entre una Asparagina (N) y un Aspartato (D) en la posición 204, mientras que la segunda variación con mayor incidencia fue en la posición 148, entre una Alanina (A) y una Glicina (G).

En relación con las enzimas vinculadas a la síntesis de exopolisacáridos, la secuencia codificante del gen epsD produce una proteína de 259 aminoácidos que forma parte de la familia de proteínas de síntesis de polisacáridos capsulares CpsB/CapC y contiene un dominio similar a PHP (polimerasa e histidiol fosfatasa). La secuencia peptídica de la proteína mostró un porcentaje de identidad superior del 98.45 %.

El análisis de identificación de operones asociados a la adherencia a superficies en L. delbrueckii subsp. bulgaricus 2038 realizado mediante el programa computacional Operon-mapper, permitió determinar que el gen correspondiente a la Pre-pilina tipo N-terminal se localizaba en un operón conformado por seis secuencias codificantes con las coordenadas genómicas 567122-570612. La unidad genética transcripcional comprende los genes: comGC, comGD, comGF, un regulador transcripcional, entre otras proteínas relacionadas a la síntesis de proteínas de membrana y adquisición de ADN exógeno.

Así mismo, se identificó que el gen srtA correspondiente a la sortasa de clase A se encontraba inmerso en un operón constituido por ocho genes localizado en la posición 1166395-1176625. Dicho operón está constituido por 8 genes, presentando un tamaño aproximado de 10.5 Kb. La unidad genética transcripcional se encuentra conformado por los genes: dnaK, dnaJ, grpE, hrcA, un regulador transcripcional, un gen codificante para una exonucleasa y una proteína de integración. Este hallazgo denota que los 8 genes que componen la unidad genética transcripcional podrían estar estructuralmente conservados, al menos entre los microorganismos L. delbrueckii subsp. lactis KCCM 34717 y L. delbrueckii subsp. bulgaricus 2038.

La síntesis de heteropolisacáridos se caracteriza por la participación de varios genes. El análisis del contexto genómico mostró que el gen epsD se encontraba en un operón asociado a la síntesis de exopolisacáridos. El operón tiene una extensión aproximada de 10.5 Kb y se compone por los genes: epsA, epsB, epsC, epsD, epsF, epsG, epsJ, epsK, epsM, entre otros. La mayoría de estos genes codifican para glucosiltransferasas y galactosiltransferasas, enzimas que catalizan la transferencia de azúcares para la síntesis de polisacáridos. El mismo análisis en L. delbrueckii subsp. lactis DSM 20072 reveló que se encuentra en un operón compuesto únicamente por 5 genes que codifican para proteínas relacionadas a la síntesis de exopolisacáridos y comprenden una extensión aproximada de 4.4 Kb, 6 Kb menos que en L. delbrueckii subsp. bulgaricus 2038. Así mismo, existe la presencia de proteínas hipotéticas, es decir enzimas con función desconocida. Es importante destacar que, ningún gen se encuentra anotado como “Eps” por lo que se infiere que la unidad genética transcripcional para la síntesis de exopolisacáridos está presente pero no se encuentra caracterizada en los genomas estudiados.

La búsqueda de factores de transcripción identificó un regulador transcripcional maestro asociado a la formación de biopelículas codificado por el gen sinR estudiado en Bacillus subtilis. Esta secuencia reguladora fue potencialmente identificada en el microorganismo Lactobacillus delbrueckii mediante un alineamiento local de secuencias peptídicas. El análisis indicó la presencia de una proteína llamada Helix-turn-helix Domain-containing con una cobertura de extensión de 45 % y un E-value de 2x10^-9.

Finalmente, la búsqueda de proteínas relacionadas a factores de transcripción con dominio Helix-turn-helix mostró la presencia de tres potenciales elementos reguladores en el 100 % de los genomas estudiados. Para el caso del regulador transcripcional, con el número de acceso WP_099279028.1 ubicado con las coordenadas genómicas 1665100-1665459 en L. delbrueckii subsp. bulgaricus 2038, se encontró que está anotado como una proteína hipotética conservada, además tiene secuencias genéticas adyacentes que codifican para proteínas hipotéticas y proteínas de biosíntesis de exopolisacáridos, entre ellas glucosiltransferasas.

Con el objetivo de identificar elementos de regulación en cis, se llevó a cabo un análisis de identificación de secuencias de unión a factores de transcripción mediante el software Oligo-analysis. Los resultados muestran una lista de motivos de unión ordenados significativamente. En la región río arriba (400 pb) de los operones que contienen los genes Prepilin-N-terminal, srtA y epsD, se identificaron ocho oligonucleótidos significativamente sobrerrepresentados (Figura 2).

Figura 2

El oligonucleótido de mayor rango, GCTGGA, se encuentra siete veces a lo largo de la secuencia región corriente arriba, mientras que se esperarían 0.47 ocurrencias por casualidad. El P-value (occ_p = 6.2 x 10^-7) indica la probabilidad de observar al menos 7 ocurrencias cuando se esperan 0.47. El número esperado correspondiente de falsos positivos es bajo (occ_E = 1.3 x 10^-3), lo que indica que es poco probable que la sobrerrepresentación sea resultado del azar. La sección correspondiente al Pattern asembly del ensamble número uno muestra que los hexanucleótidos GCTGGA y CCAGCG se pueden ensamblar para formar un solo motivo: CGCTGGA (Figura 2).